論急性早幼粒細胞白血病患者微小殘留病的檢測和臨床意義的探究

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1、論急性早幼粒細胞白血病患者微小殘留病的檢測和臨床意義的探究:任海全，唐天華，畢可紅，張玉昆，趙良玉，郭桂月，劉秀蘭，姜楓勤，劉傳芳，彭軍，田志剛［］目的檢測完全緩解后急性早幼粒細胞白血病患者微小殘留病(MRD)，同時分析其對預(yù)后判定的指導(dǎo)價值。方法建立逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT/PCR)用以檢測APL患者PML/RARα。結(jié)果RT-PCR方法敏感而可重復(fù)。治療前APL患者的RT-PCR陽性率為92.8%(39/42)，而維甲酸或化療誘導(dǎo)完全緩解后MRD陽性率為56.7%(21/37)。另外，MRD陽性和緩解后APL患者的復(fù)發(fā)有關(guān)

2、，并可以作為緩解后猜測APL患者復(fù)發(fā)的指標。同時有助于指導(dǎo)臨床上采取鞏固治療而防止復(fù)發(fā)。結(jié)論RT-PCR能夠檢測APL患者的MRD和作為猜測復(fù)發(fā)的指標。［］急性早幼粒細胞白血??；微小殘留??；RT/PCR白血病患者完全緩解（CR）后的微小殘留?。∕RD）已被證實和復(fù)發(fā)有關(guān)［1］。MRD的檢測也成為指導(dǎo)緩解后進一步化療的重要指標［2］。在目前血液病的應(yīng)用實踐中，MRD檢測的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法檢測慢性粒細胞白血?。–ML）的BCR-ABL融合基因［3］。急性早幼粒細胞性白血?。ˋPL）以特異的染色體t（15;1

3、7）（q22;q21）易位為特征［4］。最近，很多實驗室發(fā)現(xiàn)t（15;17）易位后，通過15染色體上的PML基因和17染色體上的RARα基因并列而導(dǎo)致融合基因PML/RARα形成［5］。根據(jù)PML斷裂點的位置不同，可以產(chǎn)生2個主要的PML/RARα異構(gòu)體。斷裂點位于PML內(nèi)含子3或4（bcr3），則PML外顯子3（P3）和RARα外顯子3（r3）之間形成短（S）型融合mRNA產(chǎn)物，而斷裂點位于PML內(nèi)含子6（bcr1）或下游，PML內(nèi)含子6（P6）和RARα外顯子（r3）形成長（L）型融合體［6，7］。RT-PCR法的建

4、立正是依靠于斷裂點的位置而設(shè)計適當寡核苷酸引物，繼而擴增PML/RARαmRNA異構(gòu)體［8］。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的檢測成為可能，并可在APL患者臨床緩解期時早期猜測白血病的復(fù)發(fā)。1資料和方法1.1病例選擇本探究中的42例患者均為1993～2000年發(fā)病，男26例，女16例，年齡12～72歲，根據(jù)FAB標準［9］診斷為APL。全部病例均經(jīng)全反式維甲酸（ATRA）治療［30～60mg/（m2·d）］誘導(dǎo)緩解。鞏固化療方案為標準的HOAP或DA方案。鞏固治療后處于緩解期的患者采用全國維甲酸協(xié)作治療組建議的

5、ATRA和化療聯(lián)合治療方案維持治療［10］。骨髓單個核細胞用Ficoll分離并保存于液氮中。1.2RNA提取10ml淋巴細胞分離液加于試管中，然后2ml骨髓細胞緩慢加進試管中，離心4000r/min20min。取單個核細胞移進另一試管中，再用異硫氫酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs［11］。提取時注重避免樣品間的交叉污染。1.3筑巢式RT-PCR檢測APL的PML/RARα檢測方法：8個寡核苷酸引物用于逆轉(zhuǎn)錄、擴增，檢測其長或短型異構(gòu)體。逆轉(zhuǎn)錄引物：A5?-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3?

6、PML/RARα引物：B5?-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3?D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3?G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3正常RARα轉(zhuǎn)錄引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3?K5-GACCACT

7、CTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3RT-PCR方法和步驟按照早期報道的方法進行［12］。1.4PCR產(chǎn)物分析取10μl第2輪PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠1μg/ml染色，照相。并移至尼龍膜上，用5?末端寡核苷酸探針（H）雜交，放射自顯影30min，拍片。1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗。2結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的結(jié)果及其敏感度PML/RARα的L、S異構(gòu)型（見圖1）。RT-PCR的敏感度為2.5×10-6。圖1PML/RARα類型2.2RT-PCR陽性百分率用全反

8、式維甲酸治療前APL患者PML/RARα的檢測，34例為L型陽性，5例為S型陽性。L型、S型或2型的總陽性百分率分別為80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和92.8%（39/42）。APL患者CR后的MRD陽性率是56.7%（21/37）。見表1。表1APL患者RT—PCR檢測陽性率的變化注：*2case