急性早幼粒細(xì)胞白血病患者微小殘留病的檢測(cè)與臨床意義的研究_1

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1、急性早幼粒細(xì)胞白血病患者微小殘留病的檢測(cè)與臨床意義的研究作者:任海全，唐天華，畢可紅，張玉昆，趙良玉，郭桂月，劉秀蘭，姜楓勤，劉傳芳，彭軍，田志剛［摘要］目的檢測(cè)完全緩解后急性早幼粒細(xì)胞白血病患者微小殘留病(MRD)，同時(shí)分析其對(duì)預(yù)后判斷的指導(dǎo)價(jià)值。方法建立逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT/PCR)用以檢測(cè)APL患者PML/RARα。結(jié)果RT-PCR方法敏感而可重復(fù)。治療前APL患者的RT-PCR陽(yáng)性率為%(39/42)，而維甲酸或化療誘導(dǎo)完全緩解后MRD陽(yáng)性率為%(21/37)。另外，MRD陽(yáng)性與緩解后APL患者的復(fù)發(fā)有關(guān)，并可以作為緩解后預(yù)測(cè)APL患者復(fù)

2、發(fā)的指標(biāo)。同時(shí)有助于指導(dǎo)臨床上采取鞏固治療而防止復(fù)發(fā)。結(jié)論RT-PCR能夠檢測(cè)APL患者的MRD和作為預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的指標(biāo)。［關(guān)鍵詞］急性早幼粒細(xì)胞白血?。晃⑿埩舨。籖T/PCR白血病患者完全緩解后的微小殘留病已被證實(shí)與復(fù)發(fā)有關(guān)［1］。MRD的檢測(cè)也成為指導(dǎo)緩解后進(jìn)一步化療的重要指標(biāo)［2］。在目前血液病的應(yīng)用實(shí)踐中，MRD檢測(cè)的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的BCR-ABL融合基因［3］。急性早幼粒細(xì)胞性白血病以特異的染色體t易位為特征［4］。最近，許多實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)t易位后，通過(guò)15染色體上的PML基因和17染色體上的RARα

3、基因并列而導(dǎo)致融合基因PML/RARα形成［5］。根據(jù)PML斷裂點(diǎn)的位置不同，可以產(chǎn)生2個(gè)主要的PML/RARα異構(gòu)體。斷裂點(diǎn)位于PML內(nèi)含子3或4，則PML外顯子3和RARα外顯子3之間形成短型融合mRNA產(chǎn)物，而斷裂點(diǎn)位于PML內(nèi)含子6或下游，PML內(nèi)含子6和RARα外顯子形成長(zhǎng)型融合體［6，7］。RT-PCR法的建立正是依賴(lài)于斷裂點(diǎn)的位置而設(shè)計(jì)適當(dāng)寡核苷酸引物，繼而擴(kuò)增PML/RARαmRNA異構(gòu)體［8］。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的檢測(cè)成為可能，并可在A(yíng)PL患者臨床緩解期時(shí)早期預(yù)測(cè)白血病的復(fù)發(fā)。1資料與方法病例選擇本研究中

4、的42例患者均為1993～XX年發(fā)病，男26例，女16例，年齡12～72歲，根據(jù)FAB標(biāo)準(zhǔn)［9］診斷為APL。全部病例均經(jīng)全反式維甲酸治療［30～60mg/］誘導(dǎo)緩解。鞏固化療方案為標(biāo)準(zhǔn)的HOAP或DA方案。鞏固治療后處于緩解期的患者采用全國(guó)維甲酸協(xié)作治療組建議的ATRA與化療聯(lián)合治療方案維持治療［10］。骨髓單個(gè)核細(xì)胞用Ficoll分離并保存于液氮中。1.RNA提取10ml淋巴細(xì)胞分離液加于試管中，然后2ml骨髓細(xì)胞緩慢加入試管中，離心4000r/min0min。取單個(gè)核細(xì)胞移入另一試管中，再用異硫氫酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs［11］。

5、提取時(shí)注意避免樣品間的交叉污染。1.筑巢式RT-PCR檢測(cè)APL的PML/RARα檢測(cè)方法：8個(gè)寡核苷酸引物用于逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，檢測(cè)其長(zhǎng)或短型異構(gòu)體。逆轉(zhuǎn)錄引物：A-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3PML/RARα引物：B-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3G5-AGCCTGAGGACTTGTCC

6、TGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3正常RARα轉(zhuǎn)錄引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3RT-PCR方法與步驟按照早期報(bào)道的方法進(jìn)行［12］。1.PCR產(chǎn)物分析取10μl第2輪PCR產(chǎn)物在%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠1μg/ml染色，照相。并移至尼龍膜上，用5末端寡核苷酸探針雜交，放射自顯影30min，拍片。1.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)。結(jié)果.1PCR

7、產(chǎn)物的結(jié)果及其敏感度PML/RARα的L、S異構(gòu)型。RT-PCR的敏感度為×10-6。圖1PML/RARα類(lèi)型.RT-PCR陽(yáng)性百分率用全反式維甲酸治療前APL患者PML/RARα的檢測(cè)，34例為L(zhǎng)型陽(yáng)性，5例為S型陽(yáng)性。L型、S型或2型的總陽(yáng)性百分率分別為%、%和%。APL患者CR后的MRD陽(yáng)性率是%。見(jiàn)表1。表1APL患者RT—PCR檢測(cè)陽(yáng)性率的變化注：*caseswithAPLnotgettingCR.APL患者M(jìn)RD的變化緩解不同時(shí)期的APL患者M(jìn)RD的變化。結(jié)果顯示：CR后MRD百分率降低，5～7年MRD百分率比緩解后低。另外，長(zhǎng)期C

8、R的7例中有5例生存超過(guò)7年，并且持續(xù)MRD陰性。圖2CR時(shí)間與MRD變化關(guān)系.復(fù)發(fā)與MRD之間的關(guān)系見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在2年和3年內(nèi)，MRD陰性的A