δnp73基因?qū)Υ竽c癌對大腸癌血管生成影響的實驗研究

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1、ΔNp73基因?qū)Υ竽c癌對大腸癌血管生成影響的實驗研究吳紅濤成都軍區(qū)四十四醫(yī)院內(nèi)一科貴州貴陽550009【摘要】目的：探討ΔNp73基因、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)和大腸癌血管生成的關(guān)系。方法：本研究通過將外源性的ΔNp73以基因轉(zhuǎn)染的方式在大腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)其過表達(dá)，通過觀察轉(zhuǎn)染前后VEGF表達(dá)及MVD的改變。檢索近年來研究生長抑素治療炎癥性腸病的臨床證據(jù)的文獻(xiàn)，進(jìn)行評價。結(jié)果：我們認(rèn)為ΔNp73基因可促進(jìn)VEGF的過度表達(dá),并與VEGF協(xié)同作用，使MVD增加,進(jìn)而加速了大腸癌血管的生成。結(jié)論：研究ΔNp73基

2、因與VEGF表達(dá)或腫瘤內(nèi)MVD，將有助于篩選需要輔助治療的大腸癌患者并指導(dǎo)用藥，也有助于抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)?！娟P(guān)鍵詞】ΔNp73基因大腸癌VEGF腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中有重要作用,許多研究發(fā)現(xiàn),癌基因和抑癌基因的改變可直接調(diào)控血管生成因子和血管抑制生成因子,導(dǎo)致血管增生。近年來研究顯示,ΔNp73基因與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的一種標(biāo)志。但有關(guān)ΔNp73基因與大腸癌的血管生成的影響研究報道較少，并且大多從組織病理學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析的角度進(jìn)行。本研究通過將外源性的ΔNp73以基因

3、轉(zhuǎn)染的方式在大腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)其過表達(dá)，通過觀察轉(zhuǎn)染前后VEGF表達(dá)及MVD的改變，旨在探討ΔNp73基因、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)和大腸癌血管生成的關(guān)系，以期為臨床研究大腸癌轉(zhuǎn)移和防治研究提供理論和實驗論據(jù)。材料和方法1材料?、貺OVO細(xì)胞株及真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-ΔNp73均由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤科惠贈。RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清購自Hycolone公司,胰蛋白酶購自Sigma公司脂質(zhì)體DOTAP(liposomal)和G418購自Roche公司,AMV-RTase、Taq酶、Oligo(

4、dT)15、dNTP購自Promega公司,SP免疫組化試劑盒、兔抗人VEGF單克隆抗體購自北京中山公司,RIPA蛋白提取試劑盒購自上海申能博彩公司。④AMV-RTase、Taq酶、Oli(dT)15購自Promega公司。⑤PCR引物由上海申友公司合成。⑤健康純種SPF級BALB/cA-nu裸鼠10只，購自本院實驗動物研究所，雌雄不限，4－5周齡，體重20＋2g，在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)動物研究所SPF級動物室飼養(yǎng)。2LOVO-ΔNp73細(xì)胞株的建立方法參見文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。培養(yǎng)細(xì)胞濃度至1x107后準(zhǔn)備提取總RNA和

5、蛋白。3　RT-PCR法檢測VEGF表達(dá)　按Tripure試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計定量,RNA(g/L)=A260×40×稀釋倍數(shù)/1000。AMV-RTase和Oligo(dT)15引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取5μl反轉(zhuǎn)錄cDNA作PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25μl,含10×PCRbuffer2μl,KCL10mmol/l,MgSO42mmol/L,dNTP各200μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,上下游引物各0.3μmol/L。按以下參數(shù)在PCR擴(kuò)增儀(Perkin-Elmer公司9

6、600型)上進(jìn)行。VEGF反應(yīng)條件:94℃變性70s,60℃退火60s,72℃延伸90s,經(jīng)33個循環(huán)周期后,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。β-actin反應(yīng)條件:94℃變性65s,60℃退火70s,72℃延伸110s,經(jīng)30個循環(huán)周期后,1%瓊脂糖凝膠電泳。以Gel-PROANALYZER凝膠定量分析軟件分析凝膠電泳結(jié)果,得出各條帶的積分光密度(Integralopticaldensity,IOD),以同時擴(kuò)增的β-actin為內(nèi)參對照,計算目的條帶和β-actinIOD比值即標(biāo)準(zhǔn)化積分光密度值(normalized

7、integratedintensity,NII),以NII%為單位,代表VEGFmRNA表達(dá)水平。4Western-blot檢測VEGF蛋白　按照RIPA蛋白提取試劑盒的步驟提取細(xì)胞總蛋白,采用Bradford法測定總蛋白濃度。取總蛋白40μg行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)印17h至PVDF膜,膜封閉液(1%BSA、0.02mol/L)內(nèi)封閉室溫1h,4℃過夜,PBS洗膜5min×4,加入兔抗人VEGF單克隆抗體(1∶350),37℃孵育1h,PBS洗膜5min×4,再加入羊抗兔IgG(1∶2000),37℃孵

8、育1h,PBS洗膜5min×4,化學(xué)發(fā)光試劑與PVDF膜共同孵育1min,將PVDF膜與X光片共同放暗盒曝光4min,顯影3min,定影10min。以Gel-PROANALYZER凝膠定量分析軟件分析Western-blot檢測結(jié)果,得出各條帶的灰度值,以平均灰度值代表VEGF蛋白表達(dá)水平。5ΔNp73基因?qū)Υ竽c癌血管生成影響體內(nèi)實驗①裸鼠種植瘤模型的建立將