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1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文枯草芽孢桿菌WY34產(chǎn)甘露聚糖酶及其激活劑性質(zhì)的研究姓名：韋赟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：食品生物技術(shù)指導(dǎo)教師：江正強(qiáng);李里特20060601摘要本文針對(duì)枯草芽孢桿菌(BacillusJ“6枷J)WY34所產(chǎn)甘露聚糖酶進(jìn)行了一系列研究，包括固體發(fā)酵條件的探討、蛋白純化及酶學(xué)性質(zhì)等，并第一次探討了該甘露聚糖酶激活蛋白的純化及其對(duì)該酶部分酶學(xué)性質(zhì)的影響。主要內(nèi)容和結(jié)論如下：1．枯草芽孢桿菌WY34固體發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶的最佳培養(yǎng)條件為：麩皮5g，初始水分含量71％，初始pH7．0，接種量2mL，l
2、％Tween{O，0．49魔芋粉，培養(yǎng)溫度50。C。在最適條件下培養(yǎng)5d，甘露聚糖酶酶活高達(dá)7650U／g干基，是未優(yōu)化前酶活的2．78倍，且該酶制劑僅有微弱的纖維素酶和木聚糖酶活力。2．通過(guò)鹽析、凝膠過(guò)濾及離子交換層析，得到SDS．PAGE電泳純的甘露聚糖酶，經(jīng)PAS染色被證實(shí)為一糖蛋白，純化過(guò)程酶活回收率20．3％，純化倍數(shù)為5．4倍，分子量為39，6kDa。3．對(duì)枯草芽孢桿菌WY34甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究得出：該酶反應(yīng)的最適pH為6．0，在pH5．5．10．1范圍內(nèi)穩(wěn)定；反應(yīng)最適溫度為65"(2，在溫度
3、不高于60"(2條件F均比較穩(wěn)定。Mn”、EDTA、Mg”Ag+、I}-巰基乙醇與SDS對(duì)該酶有強(qiáng)烈抑制作用，化學(xué)試劑N-bromosussinimide(NBS)則完全抑制了該酶活性；Fe2+和co”則對(duì)該酶有激活作用。該酶對(duì)不同底物都表現(xiàn)出一定的水解能力，其中以槐豆膠為底物時(shí)酶活力最高，魔芋粉次之，而對(duì)椰子甘露聚糖和瓜爾豆膠則相對(duì)酶活力較低。該酶對(duì)非甘露聚糖底物如淀粉、CMC(CarboxymethylCellulose-Na)、樺木木聚糖也有微弱活力。三種天然底物槐豆膠、精制魔芋粉及瓜爾豆膠的Jo分別是7
4、．6±0．2、10．5±0．6和27．4±2．5mg／mL。該酶對(duì)椰子甘露聚糖的水解產(chǎn)物主要是甘露四糖、甘露三糖和甘露二糖，而對(duì)槐豆膠則產(chǎn)生了一系列不同聚合度的甘露寡糖。該酶幾乎不能水解甘露三糖及甘露二糖，但能緩慢的水解甘露四糖。該酶水解甘露五糖產(chǎn)生甘露四糖、甘露三糖和甘露二糖。該酶對(duì)中性蛋白酶和胰蛋白酶的攻擊有一定的抵抗能力。4．枯草芽孢桿菌WY34產(chǎn)的甘露聚糖酶激活蛋白通過(guò)硫酸銨沉淀和DEAE-52離子交換層析兩步基本達(dá)到電泳純，純化倍數(shù)達(dá)18．4，回收率為25．9％。在SDS．PAGE上測(cè)得分子量為64．
5、59kDa。5．當(dāng)激活蛋白與枯草芽孢桿菌WY34甘露聚糖酶以2：1(w／w)的比例混合時(shí)，甘露聚糖酶活最高，：37*C為該激活劑最適作用溫度：加入激活劑后，甘露聚糖酶最適溫度及其溫度穩(wěn)定性均沒(méi)有明顯變化，但其最適pH降低了o．5個(gè)單位，pH穩(wěn)定范圍拓寬；在相同條件下水解36h，加了激活劑水解得到的產(chǎn)物與對(duì)照相同。該激活劑對(duì)大腸桿菌重組的甘露聚糖酶及甘露糖苷酶沒(méi)有明顯作用；使真菌擬青霉J18及放線菌117號(hào)所產(chǎn)的木聚糖酶活力略微增加，效果很不明顯：對(duì)擬青霉J18所產(chǎn)木糖苷酶有顯著的抑制作用。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌，
6、固體發(fā)酵，耐熱甘露聚糖酶，純化，酶學(xué)性質(zhì)，激活蛋白AbstractAthermostabte1TlalxnarlB,seanditsactivatingprominfromBacillussubfilisWY34wereinvestigatedinthepresentpaper．Thisisthefirststudyofamannanaseactivatingprotein，includingitspurificationandeffectonthepropertiesofmannanase6ⅫmBacillu
7、ssubtilisWY34TheeffectsofdifferentfactorsonmannanaseproductionbyBacillussubal括WY34insolid-statefermentationThehighestmannanaseactivitywas7650U／gdrymatteratthe50daywhenthefollowingconditionswereused：wheatbran5g，initialmoisturecontent71％，Tween-801％，konjacpowde
8、r0．4g，initialpH7．0，incubationtemperature50℃．Enzymeproductionwasincreased178％afteroptimization．PurificationoftheeulturefiltrateofBacillussubtilisWY34Mannanasewaspurified5．4-foldtohomogeneitybyamm
