2電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用

《2電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。

1、電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用王冬冬朱延明李勇李杰柏錫（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）?摘要：電子克隆是隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來(lái)的,是利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技術(shù)要求低和針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此,電子克隆技術(shù)必將成為植物基因工程中獲得新基因的重要手段。闡述了電子克隆應(yīng)用所依據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)與生物信息資源,介紹了利用電子克隆獲得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景。?關(guān)鍵詞：電子克隆;植物基因工程;表達(dá)序列標(biāo)簽EST;生物信息學(xué)電

2、子克隆(insilicocloning)是近年來(lái)伴隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法。電子克隆的技術(shù)原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù),借助電子計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力,通過(guò)EST或基因組的序列組裝和拼接,利用RT-PCR的方法快速地獲得新基因。國(guó)際上Boguski等學(xué)者在1994年開(kāi)始利用電子克隆方法發(fā)現(xiàn)新基因,中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所陳潤(rùn)生研究組在1996也開(kāi)始了對(duì)電子克隆的研究[1]。電子克隆技術(shù)應(yīng)用的前提條件要具備擬研物種的豐富核酸序列信息,其他物種的相關(guān)基因的信息,以及強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)硬件和相關(guān)生物信

3、息學(xué)分析軟件。基因組和EST資料的豐富程度決定了電子克隆得以在人類(lèi)、小鼠等生物中廣泛應(yīng)用。由于受到序列資料的限制,植物基因的電子克隆還鮮有報(bào)道。但隨著植物基因組計(jì)劃和功能基因組學(xué)的發(fā)展,電子克隆在植物基因工程研究中必將發(fā)揮出巨大的功用。1電子克隆技術(shù)及其依托的生物信息學(xué)資源1.1電子克隆的基本原理利用電子克隆方法獲得新基因是生物信息學(xué)的研究?jī)?nèi)容之一。生物信息學(xué)資源是由數(shù)據(jù)庫(kù)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分組成。而電子克隆的應(yīng)用即是基于這三部分生物信息學(xué)資源而展開(kāi)的。它是利用計(jì)算機(jī)技術(shù),依托現(xiàn)有的網(wǎng)絡(luò)資源(EST數(shù)據(jù)庫(kù)、核

4、苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等),采用生物信息學(xué)方法(包括同源性檢索、聚類(lèi)、序列拼裝等),通過(guò)EST或基因組的序列組裝和拼接,利用RT-PCR快速地獲得部分乃至全長(zhǎng)cDNA序列的方法。1.2電子克隆的實(shí)施方案首先,在數(shù)據(jù)庫(kù)或PubMed中獲得感興趣的cDNA或氨基酸序列,基于EST和基因組信息兩種數(shù)據(jù)資源,利用上述得到的已知基因序列實(shí)施電子克隆有以下兩種方案。利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息資料:①利用序列同源性比較軟件(如Blast軟件)將種子序列對(duì)庫(kù)檢索;②從數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出全部相關(guān)序列;③對(duì)所有序列進(jìn)行片段整合分析(

5、即Contig分析),形成延伸后的序列,稱(chēng)新生序列。隨后,將此新生序列作為種子序列重復(fù)進(jìn)行上述三步過(guò)程,直至新生序列不能被進(jìn)一步延伸為止,通過(guò)完整性分析即獲得了全長(zhǎng)的新基因序列[2-3]。見(jiàn)圖1。利用基因組信息資料:把作為信息探針的氨基酸或核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站中對(duì)特定物種各基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析,從結(jié)果中篩選出感興趣的外顯子序列,并通過(guò)鏈接得到其所在的基因組序列,同時(shí)根據(jù)比對(duì)的結(jié)果對(duì)基因組序列可能造成的移碼測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行修正;把這些感興趣的外顯子序列按照其所在基因組上的位置依次進(jìn)行直接連接,或者把基因組序列提

6、交到GenScan和GeneFinder等網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè),得到可能的新基因序列。有時(shí)各外顯子分別處于較短的尚未組裝的基因組序列中,也可按探針基因外顯子順序進(jìn)行直接拼接;把可能的新基因序列基于核酸數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST分析,檢驗(yàn)其新穎性;把篩選后的新基因序列提交到dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST分析并延伸,同時(shí)也是進(jìn)一步確認(rèn)其真實(shí)存在的可信度,并進(jìn)行組織表達(dá)定位,為克隆該基因提供組織來(lái)源信息。最后根據(jù)最終的序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)得到新基因[4]。見(jiàn)圖2。?1.3電子克隆依據(jù)的網(wǎng)絡(luò)分析程序和應(yīng)用軟件1.3.1序列的相似性

7、檢索分析程序一條序列對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析以發(fā)現(xiàn)其同源序列是電子克隆中的一個(gè)極其重要的方面。目前使用最廣泛的程序是FASTA和BLAST。FASTA集中反映具有顯著意義的序列對(duì)齊結(jié)果。在互聯(lián)網(wǎng)上已有許多的在線FASTA查找服務(wù),同時(shí)也可下載后離線使用,下載站點(diǎn):ftp://ftp.vir.ginia.edu/pub/fasta/dos/。BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,基本局部比對(duì)搜索工具)則采用了一種短片段匹配算法和一種有效的統(tǒng)計(jì)模型來(lái)找出目的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)之間的最佳局部對(duì)齊

8、效果。目前在互聯(lián)網(wǎng)上有許多在線的BLAST查找程序,專(zhuān)門(mén)用于查找各大數(shù)據(jù)庫(kù)中與用戶(hù)提交的序列同源的序列,如:NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.html)和EMBL(http://www.ebi.ac.uk/blast2)和EBI的FASTA(http://www.ebi.ac