2電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用new

《2電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用new》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用王冬冬朱延明李勇李杰柏錫（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）?摘要：電子克隆是隨著基因組計劃和EST計劃的實施而發(fā)展起來的,是利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技術(shù)要求低和針對性強等優(yōu)點。因此,電子克隆技術(shù)必將成為植物基因工程中獲得新基因的重要手段。闡述了電子克隆應(yīng)用所依據(jù)的數(shù)據(jù)庫與生物信息資源,介紹了利用電子克隆獲得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景。?關(guān)鍵詞：電子克隆;植物基因工程;表達(dá)序列標(biāo)簽EST;生物信息學(xué)電子克隆(insilicocloning)是近年來

2、伴隨著基因組計劃和EST計劃發(fā)展起來的基因克隆新方法。電子克隆的技術(shù)原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù),借助電子計算機的巨大運算能力,通過EST或基因組的序列組裝和拼接,利用RT-PCR的方法快速地獲得新基因。國際上Boguski等學(xué)者在1994年開始利用電子克隆方法發(fā)現(xiàn)新基因,中國科學(xué)院生物物理研究所陳潤生研究組在1996也開始了對電子克隆的研究[1]。電子克隆技術(shù)應(yīng)用的前提條件要具備擬研物種的豐富核酸序列信息,其他物種的相關(guān)基因的信息,以及強大的計算機硬件和相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件?；蚪M和EST資料的豐富程度決定了電子克隆得以在人類、小鼠等生物中廣泛應(yīng)用。由于受

3、到序列資料的限制,植物基因的電子克隆還鮮有報道。但隨著植物基因組計劃和功能基因組學(xué)的發(fā)展,電子克隆在植物基因工程研究中必將發(fā)揮出巨大的功用。1電子克隆技術(shù)及其依托的生物信息學(xué)資源1.1電子克隆的基本原理利用電子克隆方法獲得新基因是生物信息學(xué)的研究內(nèi)容之一。生物信息學(xué)資源是由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分組成。而電子克隆的應(yīng)用即是基于這三部分生物信息學(xué)資源而展開的。它是利用計算機技術(shù),依托現(xiàn)有的網(wǎng)絡(luò)資源(EST數(shù)據(jù)庫、核苷酸數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫等),采用生物信息學(xué)方法(包括同源性檢索、聚類、序列拼裝等),通過EST或基因組的序列組裝和拼接,利用RT

4、-PCR快速地獲得部分乃至全長cDNA序列的方法。1.2電子克隆的實施方案首先,在數(shù)據(jù)庫或PubMed中獲得感興趣的cDNA或氨基酸序列,基于EST和基因組信息兩種數(shù)據(jù)資源,利用上述得到的已知基因序列實施電子克隆有以下兩種方案。利用EST數(shù)據(jù)庫信息資料:①利用序列同源性比較軟件(如Blast軟件)將種子序列對庫檢索;②從數(shù)據(jù)庫中挑選出全部相關(guān)序列;③對所有序列進(jìn)行片段整合分析(即Contig分析),形成延伸后的序列,稱新生序列。隨后,將此新生序列作為種子序列重復(fù)進(jìn)行上述三步過程,直至新生序列不能被進(jìn)一步延伸為止,通過完整性分析即獲得了全長的新基因序列[2-3]。見圖

5、1。利用基因組信息資料:把作為信息探針的氨基酸或核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站中對特定物種各基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析,從結(jié)果中篩選出感興趣的外顯子序列,并通過鏈接得到其所在的基因組序列,同時根據(jù)比對的結(jié)果對基因組序列可能造成的移碼測序錯誤進(jìn)行修正;把這些感興趣的外顯子序列按照其所在基因組上的位置依次進(jìn)行直接連接,或者把基因組序列提交到GenScan和GeneFinder等網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測,得到可能的新基因序列。有時各外顯子分別處于較短的尚未組裝的基因組序列中,也可按探針基因外顯子順序進(jìn)行直接拼接;把可能的新基因序列基于核酸數(shù)據(jù)庫做BLAST分析,檢驗其新穎性;把篩選后的

6、新基因序列提交到dbEST數(shù)據(jù)庫做BLAST分析并延伸,同時也是進(jìn)一步確認(rèn)其真實存在的可信度,并進(jìn)行組織表達(dá)定位,為克隆該基因提供組織來源信息。最后根據(jù)最終的序列設(shè)計引物,進(jìn)行RT-PCR實驗得到新基因[4]。見圖2。?1.3電子克隆依據(jù)的網(wǎng)絡(luò)分析程序和應(yīng)用軟件1.3.1序列的相似性檢索分析程序一條序列對整個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性分析以發(fā)現(xiàn)其同源序列是電子克隆中的一個極其重要的方面。目前使用最廣泛的程序是FASTA和BLAST。FASTA集中反映具有顯著意義的序列對齊結(jié)果。在互聯(lián)網(wǎng)上已有許多的在線FASTA查找服務(wù),同時也可下載后離線使用,下載站點:ftp://ftp.v

7、ir.ginia.edu/pub/fasta/dos/。BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,基本局部比對搜索工具)則采用了一種短片段匹配算法和一種有效的統(tǒng)計模型來找出目的序列和數(shù)據(jù)庫之間的最佳局部對齊效果。目前在互聯(lián)網(wǎng)上有許多在線的BLAST查找程序,專門用于查找各大數(shù)據(jù)庫中與用戶提交的序列同源的序列,如:NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.html)和EMBL(http://www.ebi.ac.uk/blast2)和EBI的FASTA(http://www.ebi.ac