實(shí)時(shí)熒光定量pcr在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用

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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用蔣永林湖南省永州市疾病預(yù)防控制中心425000【摘要】目的：探究實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用價(jià)值。方法：選取2013年1月至2014年12月在我市采集的流感樣病例咽拭子1624例用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測流感病毒核酸，分析檢測的陽性率與陽性病例樣木類型，總結(jié)流感流行趨勢。結(jié)果：1624例咽拭子樣木中流感病毒核酸呈陽性419例，陽性檢出率為25.80%。陽性樣木中甲型流感病毒H1N1亞型164例，占39.14%，甲型流感病毒H3亞型176例，占42.0%;乙型流感病毒7

2、9例，占18.85%。不同類型的流感病毒陽性檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可迅速、準(zhǔn)確的檢測流感病毒核酸，有助于分析流感病毒的類型與流行趨勢，為預(yù)防流感發(fā)牛.提供參考依據(jù)。【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)焚光定量PCR;流感；病毒核酸；檢測流行性感冒［1-3］(簡稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)為起病急、高熱、頭痛伴有嚴(yán)重不適、干咳、咽喉疼痛等癥狀。流感潛伏期短，傳播迅速，病毒抗原易變異，人群對(duì)變異株普遍易感。2009年甲型H1N1流感自墨丙哥爆發(fā)后迅速蔓延全球，引發(fā)了人們對(duì)流感的

3、恐慌，同時(shí)也引起了人們對(duì)預(yù)防流感的重視［4］。為有效預(yù)防流感的流行，加強(qiáng)對(duì)流感病毒的快速檢測能力，木文研究了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用效果，現(xiàn)將報(bào)道如下。1資料與方法1.1一般資料選取2013年1月至2014年12月在我市收集的流感樣病例的咽拭子共1624例。所有咽拭子均是擦拭疑似流感患者的雙側(cè)咽扁桃體或咽后壁。咽拭子采集后置于含4.0ml的Hank′s液中，暫時(shí)于4.0°C冰箱中保存，并于24小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室收到樣本后先在旋窩震蕩器上震蕩5秒鐘并取出拭子，編好號(hào)后置負(fù)70.0°C冰箱中

4、保存。1.2試劑與設(shè)備核酸提取試劑盒為ViralRNA/DNAMiniKit（美國Invitrogen公司）；熒光定量檢測試劑盒為：甲型流感病毒核酸測定試劑盒（熒光PCR法）、乙型流感病毒核酸測定試劑盒（熒光PCR法）、甲型H1N1流感病毒核酸測定試劑盒（熒光PCR法）、甲型流感病毒H3亞型核酸測定試劑盒（熒光PCR法）（上海之江生物科技有限公司）；焚光定量PCR儀（美國AB公司）、低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。1.3研究方法樣本核酸提取按試劑盒ViralRNA/DNAMiniKit說明書進(jìn)行。PCR檢測反應(yīng)體系

5、總體積為25.0ul：取檢測混合液19.0ul,加酶混合液l.Oul（內(nèi)含逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶），最后加入5.0ul待測樣本核酸提取液，震蕩混勻并短暫離心后上機(jī)檢測。PCR反應(yīng)條件為：45.0°C,lOmin,95.0°C,15min；95.0°C,15sec,60.0°C,lmin,共40個(gè)循環(huán)，單點(diǎn)熒光檢測在60.0°C吋進(jìn)行。1.4觀察指標(biāo)統(tǒng)計(jì)采用實(shí)吋熒光定量PCR技術(shù)檢測流感病毒的陽性率，并分析陽性樣本的類型。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢

6、驗(yàn)，以P<0.05作為差異具冇統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1PCR檢測結(jié)果分析表1流感病毒核酸PCR檢測結(jié)果本研宄采集的1624例咽拭子樣本經(jīng)實(shí)吋熒光定量PCR技術(shù)檢測后共證實(shí)流感病毒核酸呈陽性419例，陽性檢出率為25.80%。陽性樣本中甲型流感病毒H1N1亞型164例，占39.14%;甲型流感病毒H3亞型176例，占42.0%;乙型流感病毒79例，占18.85%。不冋類型的流感病毒陽性檢出率差異具奮統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)o詳見表1。3討論流行性感冒是急性呼吸系統(tǒng)常見疾病，主要是由流感病毒引起的，具奮感染性強(qiáng)、

7、潛伏期短、病情發(fā)展迅速等特點(diǎn)，患者臨床表現(xiàn)多為高熱、乏力、呼吸系統(tǒng)疾病癥狀等，嚴(yán)重威脅人類生命健康［7,8】。相關(guān)研究表明［9］，流感病毒致病率高，而且隨著藥物廣泛治療，病毒的變異性逐漸提高。為了降低發(fā)生大范圍的流感病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，必須加強(qiáng)對(duì)流感病毒的預(yù)防［10】。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)是利用PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，并利用熒光信號(hào)實(shí)吋積累并監(jiān)測整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)檢測B標(biāo)物進(jìn)行定量分析，是臨床上用于病毒核酸定量檢測的常用方法。因此，筆者研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測流感病毒核酸的應(yīng)用效果，旨在為臨床應(yīng)用提

8、供參考。本研宄通過對(duì)1624例疑似流感患者咽拭子樣本進(jìn)行實(shí)吋熒光定量PCR技術(shù)檢測，共檢測出甲型流感病毒H1N1亞型164例，占39.14%;甲型流感病毒H3亞型176例，占42.00%;乙型流感病毒79例，占18.85%。研究結(jié)果提示實(shí)吋熒光定量PCR技術(shù)對(duì)甲