實時熒光定量pcr 在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用

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1、實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用周雪花云南省文山州疾病預(yù)防控制中心，云南文山663000[摘要]目的探討實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用效果。方法選取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件進(jìn)行分析，采用實時熒光定量PCR對流感病毒核酸進(jìn)行檢測，觀察檢測陽性率和陽性樣本的類型，以分析流感的流行趨勢。結(jié)果2009年9月—2013年12月共檢出流感病毒核酸陽性676件，檢測陽性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，

2、占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。每年6~9月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢，在10~11月達(dá)到高峰期；6~9月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，10~11月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。結(jié)論實時熒光定量PCR是一種科學(xué)有效的檢測方法，可對流感病毒核酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。[.jyqklEppendorf管，加入500ulRLT。②取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）100uL，加入上述Eppendorf管中。③加5uLβ-巰基乙醇，充分混勻。④

3、加600uL70%乙醇，于旋轉(zhuǎn)混合器混勻。⑤從試劑盒中取出帶濾膜的離心柱，并標(biāo)上標(biāo)本號。⑥將第4步的混合液分兩次（每次600uL）吸入于濾柱中，12000rpm離心15s，棄收集管中的離心液。⑦濾柱仍放回收集管上，將第4步的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm離心15s，棄收集管中液體。⑧于濾柱中加入700uLRasterMix12.5uL60℃5min/50℃30min/95℃15min(1個循環(huán))RT-Mix0.25uL95℃15s/55℃30s/(收集熒光)/72℃30sDH2O5.75uL（45個循環(huán)）F(5′上游引物使用液)0.5uL72℃5min（1個循環(huán)）R(3′下

4、游引物使用液)0.5uLP（寡核苷酸探針使用液）0.5uL③新甲型H1N1(豬甲流-2009)—北京金豪試劑反應(yīng)體系（按n+2用量配制）及其反應(yīng)條件。H1N1各反應(yīng)液2000rpm離心10s50℃30min/95℃3min（1個循環(huán)）（FLuA、Sin各反應(yīng)液分別加逆轉(zhuǎn)錄酶0.35uL（5個循環(huán)）DNA聚合酶1uL（混勻離心）95℃10s/55℃40s(收集熒光)（45個循環(huán)）于提取間，反應(yīng)體系20uL+模板RNA提取液5uL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。陽性：Ct值＜35.0，并且呈現(xiàn)S形曲線,陰性：Ct值為0。1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗

5、，計量資料采用t檢驗，用（x±s）表示，P＜0.05說明具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1流感病毒核酸檢測陽性率2009年9月—2013年12月的2489件流感樣病例咽拭子中，共檢出流感病毒核酸陽性676件，陽性檢出率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。2.2流感病毒流行特征每年6~9月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢，在10月~次年3月達(dá)到高峰期；6~9月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行

6、病株，10月~次年3月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。3討論流感之一種急性呼吸系統(tǒng)疾病，主要由流感病毒引起，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、酸痛、乏力、呼吸道癥狀等。流感傳染性強(qiáng)、潛伏期短、傳播迅速，可分為甲、乙、丙三種類型，其中以甲型流感對人們的威脅最大[3-4]，因而必須加強(qiáng)對流感的檢測和防控。流感病毒致病能力較強(qiáng)，而且容易發(fā)生變異，而且人們對特異性菌株缺乏必要的免疫力，因而會導(dǎo)致流行暴發(fā)。相關(guān)研究表明，一場大型流感會導(dǎo)致整個地區(qū)的壽命降低[5]，因而必須加強(qiáng)流感的防控，為此我市疾病防控中心采用實時熒光定量PCR對流感病毒核酸進(jìn)行檢測，取得了良好的效果。實時熒光定量PCR檢測具有明顯

7、的優(yōu)點，相比于普通的RT-PCR檢測來說，其實驗周期更短，靈敏度更低，而且不容易造成實驗室污染[6]。實時熒光定量PCR檢測能夠利用PCR對DNA的高效擴(kuò)增、光譜技術(shù)的敏感性和探針技術(shù)的特異性，敏感性較高，重復(fù)性好，而且更為直觀，操作簡單，容易操作，采用閉管檢測對實驗室的污染能夠降到最低，因而具有良好的實用性；采用磁珠法進(jìn)行提取核酸，能夠最大限度的結(jié)合核酸，而且清洗效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)自動化提取，操作方便[7-8]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，2009年9月—2013年12月共檢出流