人白細(xì)胞介素1受體拮抗基因的克隆及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)

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1、人白細(xì)胞介素1受體拮抗基因的克隆及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)　　摘要:目的獲得一株重組人白細(xì)胞介素1受體拮抗蛋白的高效表達(dá)菌株，為研究各種急慢性炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制以及拮抗IL-1的生物學(xué)效應(yīng)奠定基礎(chǔ).方法分離人外周血淋巴細(xì)胞，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄PCR獲得人白細(xì)胞介素1受體拮抗基因（hIL-1ra），克隆入大腸桿菌表達(dá)載體，從而構(gòu)建高效表達(dá)人IL-1ra的重組菌株.結(jié)果成功構(gòu)建了IL-1ra的高效表達(dá)菌株（pLDH-hIL1ra），序列測定與文獻(xiàn)報(bào)道一致.12%SDS-PAGE分析顯示此菌株所表達(dá)的目的蛋白產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為2

2、3ku，與預(yù)期結(jié)果相符.光密度掃描重組hIL-1ra蛋白質(zhì)占細(xì)菌總蛋白的30%.結(jié)論在大腸桿菌中成功地表達(dá)了hIL-1ra基因.　　Keyen;receptors，interleukin-1;genes;geneex-pression;Escherichiacoli　　Abstract:AIMToobtainahighexpressioncloneofhumaninterleukin1receptorantagonist（hIL-1ra），portanceinthepathogenesisofbothacuteandchro

3、nicinflammatorydiseasesandapetitiveinhibitorofthebindingofIL-1toIL-1R.METHODSmRNAhumanperipheralbloodmonocytes（PBMC），andthecodingsequenceofhIL-1raplifiedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction.Theexpressionvec-torpLDH-hHIL1raperatureinduction，theIL1-raolecula

4、ranIL-1rahaseffectivelybeenexpressedinE.coli.　　0引言　　人白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（interleukin-1recep-torantagonist，IL-1ra）是在某些白血病患者血清和尿中以及單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)一種多肽性質(zhì)的IL-1特異性抑制因子，可由LPS刺激的單核細(xì)胞，PMA，PHA，CSF刺激的單核細(xì)胞系產(chǎn)生［1］.實(shí)驗(yàn)表明，LI-1ra可阻斷LPS引起的家兔死亡、減輕免疫復(fù)合物所誘導(dǎo)的炎癥、抑制小鼠骨髓移植后GVHR的發(fā)生、提高存活率、并能防治動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎［2

5、，3］.在臨床上，IL-1ra可用于治療敗血已進(jìn)入Ⅲ期臨床驗(yàn)證）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、膿毒癥、化膿性休克等［4］;在基礎(chǔ)研究中，IL-1ra可以用于研究急慢性炎癥的發(fā)病機(jī)制.因此，利用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)IL-1ra，無論是在基礎(chǔ)研究還是在臨床應(yīng)用均具有重要意義.　　1材料和方法　　1.1材料表達(dá)載體pLDH99由本室趙忠良構(gòu)建（Fig1）;大腸桿菌DH5α由本室保存.正常成人外周血取自趙忠良.PCR引物由Cybersyn公司合成（引物序列為:ATAATGCGACCCTCTGGGA-GAAAATC，CTGGATCCTACTCGTCC

6、TC-CTGGAAG），淋巴細(xì)胞分離液（ρ=1.077）購自Sig-ma;polyATractSystem1000mRNA分離試劑盒購自Promega公司;SupercriptIITM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4DNAligase等購自GibcoRBL公司，KlenTaq高保真PCR試劑盒購自Clontech公司;QIAEXⅡ凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司.SequenceofsMCSs:102030AGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATT405060TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATA

7、TCGGATC708090CTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCT100110TGGCACTGGCCGTCGTTTTACAGCTT　　圖1略　　1.2方法　　1.2.1人IL-1ra基因的克隆正常成人外周血經(jīng)梯度離心（梯度離心液ρ=1.077）后，收集交界層的PBMC，以Hank’液洗3遍后，以1×106個(gè)細(xì)胞在含20mgL-1PHA的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃，50mLL-1CO2中培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，用polyATractSystem1000試劑得到純化的mRNA，Supercrip

8、tIITM反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，進(jìn)行PCR參數(shù)為95℃，15s;55℃，30s;72℃，30s，共25個(gè)循環(huán).　　　　1.2.2人IL-1ra基因在載體中的定向克隆將表達(dá)載體pLDH99用EcoRV與BamHI雙酶切，制備成一平一粘的載體片段;同時(shí)PCR產(chǎn)物也經(jīng)BamHI酶切制備