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1、大鼠β細(xì)胞素基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)論文安家澤，宋振順，竇科峰，李開宗，韓驊【關(guān)鍵詞】基因克隆【Abstract】AIM:Toobtainlargeamountofratbetacellulinsoastoexplorethefunctionoftheproteinandpreparetheantibodyagainstthisprotein.METHODS:A544bpofratbetacellulingenefragmentplifiedbyPCRmethodfromratkidneyandclonedintopET28a（+）vector,anE.co
2、liexpressionvector,toconstructarebinantplasmidpET28arBTC.TheplasmidedintoE.coliBL21(DE3)andinducedtoexpressbetacellulinolecularostininclusionbodysections.CONCLUSION:Cloningandexpressionofbetacellulingenelayabasisforthefurtherstudyonthefunctionofthisproteinandpancreaticstemcelldifferent
3、iation.【Keyacia公司產(chǎn)品);ECL發(fā)光試劑(PIERCE公司).1.2方法1.2.1β細(xì)胞素基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定①引物設(shè)計(jì)合成：根據(jù)GenBank中大鼠β細(xì)胞素基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18bp)，下游引物：5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20bp)，其中上、下游引物的5′端分別引入EcoRI和SalI酶切位點(diǎn).②目的基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定：應(yīng)用PCR試劑盒擴(kuò)增目的基因，總反應(yīng)體積為50μL，循環(huán)參數(shù)為：95℃4min;95℃30s,55℃30s,72℃1min，35個(gè)循環(huán)，再于7
4、2℃延伸7min.③目的基因的序列測(cè)定：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體pMD18T中,構(gòu)建pMD18TrBTC，酶切鑒定正確后，交由上海生工公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定.1.2.2β細(xì)胞素原核表達(dá)載體的構(gòu)建以EcoRI和SalI雙酶切經(jīng)測(cè)序正確的PMD18TrBTC，獲取β細(xì)胞素基因.以EcoRI和SalI雙酶切pET28a（+）載體，分別回收β細(xì)胞素基因和pET28a（+）載體片段，SolutionI連接上述基因和載體片段，構(gòu)建β細(xì)胞素原核表達(dá)載體pET28（a+）rBTC，轉(zhuǎn)化E.coliXL10感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，小量提取質(zhì)粒并酶切鑒定.1.
5、2.3β細(xì)胞素的原核表達(dá)及檢測(cè)以β細(xì)胞素原核表達(dá)載體pET28（a+）rBTC轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取用含卡那霉素的LB平板篩選的陽(yáng)性克隆于LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜，按1∶100轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基2mL中，37℃振搖約3h，使A600nm約0.6（0.4~1.0），加入終濃度0.5mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)3h.于4℃離心15000g×1min，收集菌體并裂解，4℃離心15000g×10min，分別取上清及沉淀（包涵體），進(jìn)行SDSPAGE和D18T，形成pMD18TrBTC，酶切鑒定得到正確克隆，以M13+/M13-為引物進(jìn)行序列測(cè)定.測(cè)
6、序結(jié)果與GenBank中大鼠β細(xì)胞素基因序列比對(duì)無突變.2.2大鼠β細(xì)胞素原核表達(dá)載體pET28arBTC構(gòu)建用EcoRI和SalI雙酶切pMD18TrBTC，回收片段后與經(jīng)過相同酶切的pET28a（+）片斷連接，轉(zhuǎn)化E.coliXL10感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，挑單克隆擴(kuò)增小量提取質(zhì)粒并酶切鑒定.EcoRI和SalI雙酶切得到的片段，與預(yù)期的大小一致.2.3pET28arBTC的原核表達(dá)及鑒定將原核表達(dá)載體pET28arBTC轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可見Mr為20000的融合蛋白，主要以包涵體形式表達(dá).以an
7、tiHis一抗做aruiT,etal.Expressionofbetacellulin,heparinbindingepidermalgroanmalignantfibroushistiocytoma［J］.AnticancerRes,2004;24(3b):2007-2010.［4］LiL,SenoM,YamadaH,etal.Promotionofbetacellregenerationbybetacellulininniypercentpancreatectomizedrats［J］.Endocrinology,2001;142(12):5379-5385
