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《大鼠β細胞素基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、大鼠β細胞素基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達：安家澤，宋振順，竇科峰，李開宗，韓驊【關(guān)鍵詞】基因克隆 【Abstract】AIM:Toobtainlargeamountofratbetacellulinsoastoexplorethefunctionoftheproteinandpreparetheantibodyagainstthisprotein.METHODS:A544bpofratbetacellulingenefragmentplifiedbyPCRmethodfromratkidneyandclonedintop
2、ET28a（+）vector,anE.coliexpressionvector,toconstructarebinantplasmidpET28arBTC.TheplasmidedintoE.coliBL21(DE3)andinducedtoexpressbetacellulinolecularostininclusionbodysections.CONCLUSION:Cloningandexpressionofbetacellulingenelayabasisforthefurtherstudyonthefunctionof
3、thisproteinandpancreaticstemcelldifferentiation. 【Keyacia公司產(chǎn)品);ECL發(fā)光試劑(PIERCE公司). 1.2方法 1.2.1β細胞素基因的擴增及序列測定①引物設(shè)計合成：根據(jù)GenBank中大鼠β細胞素基因序列，設(shè)計引物，上游引物序列為：5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18bp)，下游引物：5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20bp)，其中上、下游引物的5′端分別引入EcoRI和SalI酶切位點.②目的基因的擴增及序列測定：應(yīng)用PC
4、R試劑盒擴增目的基因，總反應(yīng)體積為50μL，循環(huán)參數(shù)為：95℃4min;95℃30s,55℃30s,72℃1min，35個循環(huán)，再于72℃延伸7min.③目的基因的序列測定：將PCR擴增產(chǎn)物克隆入載體pMD18T中,構(gòu)建pMD18TrBTC，酶切鑒定正確后，交由上海生工公司進行DNA序列測定. 1.2.2β細胞素原核表達載體的構(gòu)建以EcoRI和SalI雙酶切經(jīng)測序正確的PMD18TrBTC，獲取β細胞素基因.以EcoRI和SalI雙酶切pET28a（+）載體，分別回收β細胞素基因和pET28a（+）載體片段，Solution
5、I連接上述基因和載體片段，構(gòu)建β細胞素原核表達載體pET28（a+）rBTC，轉(zhuǎn)化E.coliXL10感受態(tài)細胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，小量提取質(zhì)粒并酶切鑒定. 2結(jié)果 2.1β細胞素基因的擴增、克隆及序列測定β細胞素基因的PCR產(chǎn)物10g/L瓊脂糖凝膠電泳可見544bp特異性條帶（Fig1），回收片段后插入pMD18T，形成pMD18TrBTC，酶切鑒定得到正確克隆，以M13+/M13-為引物進行序列測定.測序結(jié)果與GenBank中大鼠β細胞素基因序列比對無突變. 2.2大鼠β細胞素原核表達載體pET28
6、arBTC構(gòu)建用EcoRI和SalI雙酶切pMD18TrBTC，回收片段后與經(jīng)過相同酶切的pET28a（+）片斷連接，轉(zhuǎn)化E.coliXL10感受態(tài)細胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，挑單克隆擴增小量提取質(zhì)粒并酶切鑒定.EcoRI和SalI雙酶切得到的片段，與預(yù)期的大小一致. 2.3pET28arBTC的原核表達及鑒定將原核表達載體pET28arBTC轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導后，可見Mr為20000的融合蛋白，主要以包涵體形式表達.以antiHis一抗做,etal.ActivinAandb
7、etacellulin:Effectonregenerationofpancreaticbetacellsinneonatalstreptozotocintreatedrats［J］.Diabetes,2004;53(3):608-615. ?。?］YamamotoT,AkisueT,MaruiT,etal.Expressionofbetacellulin,heparinbindingepidermalgroanmalignantfibroushistiocytoma［J］.AnticancerRes,2004;24(3b):
8、2007-2010. ?。?］LiL,SenoM,YamadaH,etal.Promotionofbetacellregenerationbybetacellulininniypercentpancreatectomizedrats［J］.Endocrinology,2001
