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《膽固醇氧化酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、摘要膽固醇氧化酶基因是近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種抗蟲(chóng)基因。膽固醇氧化酶對(duì)其敏感害蟲(chóng)一鞘翅目的棉鈴象甲的毒殺能力與早期發(fā)現(xiàn)的Bt.毒蛋白相當(dāng)，對(duì)鱗翅目的一些害蟲(chóng)如煙蚜夜蛾等也有較強(qiáng)的抑制其生長(zhǎng)發(fā)育的作用。因?yàn)樗亩練⒛芰?qiáng)，而且其殺蟲(chóng)譜又與現(xiàn)在廣泛使用的Bt.毒蛋白具有一定的互補(bǔ)性，所以被認(rèn)為是繼Bt毒蛋白之后的第二代殺蟲(chóng)蛋白的代表之一。另外，在臨床上膽固醇氧化酶可以與膽固醇脂酶和過(guò)氧化氫酶一起作為血漿總膽固醇含量的檢鋇賦劑，用以診斷冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病。因此，對(duì)膽固醇氧化酶的研究越來(lái)越受到重視。本研究采用
2、PCR方法從分泌膽固醇氧化酶的馬紅球菌菌株42G2基因組DNA中，擴(kuò)增出特異DNA片段，該擴(kuò)增片段全長(zhǎng)約1.6kb。對(duì)片段進(jìn)行克隆、亞克隆之后測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)與己克隆的來(lái)源于馬紅球菌的膽固醇氧化酶基因choE有99的同源性;并且三次獨(dú)立的PCR均得至湘同的片段，所克隆的基因序列與chcE相比，連續(xù)缺失三個(gè)堿基〔TTC).即相應(yīng)的氨基酸序列缺失一個(gè)氨基酸(Phe)，因此判斷所克隆的基因片段與choE屬同一基因家族或原有基因的天然突變體，命名為choEW,利用pET-His等不同表達(dá)載體和大腸桿菌TOP10F,BL2
3、1(DE3)plysS表達(dá)宿主菌，成功構(gòu)建了膽固醉氧化酶基因的不同原核表達(dá)系統(tǒng).其結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE分析表明:以pET-His為表達(dá)載體，大腸桿菌B121(DE3)plysS為宿主菌的重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出約56kD的特異蛋白，蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相一致。經(jīng)過(guò)氧化氫酶法檢測(cè)表達(dá)蛋白，表明表達(dá)產(chǎn)物具有膽固醇氧化酶酶活。本研究從我國(guó)自行分離的馬紅球菌42G2菌株中分離到一種編碼膽固醇氧化酶的新基因choEW，它將可應(yīng)用于臨床檢測(cè)、保健食品和農(nóng)業(yè)抗蟲(chóng)等領(lǐng)域;同時(shí)利用原核表達(dá)載體成功的在大腸桿菌中表達(dá)了目的基因，表現(xiàn)出膽
4、固醇氧化酶酶活，為膽固醇氧化酶的基因工程利用開(kāi)發(fā)作了一定的理論實(shí)驗(yàn)蜘韻研究。膽固醇氧化酶，抗蟲(chóng)基因，原核表達(dá)AbstractCholesteroloxidaseisatypeofproteinthatwasfoundtohavepest-resistantactivity。吻yearsago,itstoxitytosuchsensitivepestsascottonbollweeviliseuqivalenttopreviouslyfound及endotoxins.Theproteincanalsoinhibi
5、tthegrowthanddevelopmentofcottonbol~·BecauseofitshightoxityactivityandcomplementaryinseticidalspectrumwithBt.endotoxinwhichisnowbeinguseduniversally,thecholesteroloxidaseisacknowlegedasoneoftherepresentitiveoftheinsecticidalproteinofthesecondgeneration.Moreo
6、ver,togetherwithcholesterolesteraseandcatalyse,cholesteroloxidasecanbeusedastestreagenttodeterminethetotalcholesterolcontentinbloodplasmaforthediagnosisofsuchascardiovascularreflexandatherosclerosisclinicaly.Therefore,researchoncholesteroloxidasehasbecomemor
7、eandmore加po比過(guò)t.A1.6kbDNAfragmentwasamplifiedusingPCRmethodfromgenomicDNAofRhodococcwequ,42G2.Sequenceanalysisshowedthat,thisfragmenthasahomologyof99%tothepreviouslyreportedchoEfromRhodococcuseqwaftercloningandsubcloningandthreeidenticalfragmentswereobtainedf
8、romthreeindependentPC民lackingthreecontinualbases(TC,encodingthePheaminoacid)comparedwithchoE,thusitcanbeassumedthatthenewfragment,designatedaschoEW,andchoEbelongtothesamegenefamily,evenitmightbe
