western-blot實(shí)驗(yàn)

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1、Westernblotting檢測(cè)大腸桿菌重組蛋白1.背景印跡法(blotting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱力Southernblotting。之后，JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark三位教授又發(fā)明丫RNA雜交檢測(cè)技術(shù)，因與Southernblotting相似，故命名力Northernblotting。GeorgeStar

2、k這位教授在兩年后又開(kāi)發(fā)出類似的蛋白質(zhì)檢測(cè)力‘法。1981年，在NealBurnette所者的AnalyticalBiochemistry屮，酋次將單向也泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱力Westernblotting。此后開(kāi)發(fā)的Easternblotting是Westernblotting的變形，對(duì)雙向也泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱力Easternblotting。30年來(lái)，Westernblotting技術(shù)己成力蛋白質(zhì)研究巾最常用的工具，川于鑒定目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中，蛋白質(zhì)的表達(dá)情況(上調(diào)或下調(diào)表達(dá))和不同的樣品之間的表達(dá)差

3、異性。pET系統(tǒng)是在￡//中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦肳esternBlotting技術(shù)，定性(或定量)檢測(cè)苦養(yǎng)黃酮醇合酶基因(Flavonolsynthasegene,FtFLS)在大腸桿菌表達(dá)宿主菌Evc/7?BL(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)

4、。3.實(shí)驗(yàn)原理黃酮醇合酶(FLS,EC1.14.11.23)屬于2-ODD家族，催化黃酮醇合成支路屮最后一步氧化反應(yīng)，也是直接合成黃酮醇的反應(yīng)。FLS可以使二氫黃酮醇在C3鏈屮(32和(33之間氧化形成雙鍵，從而生成黃酮醇：aDihydroflavonol+2-oxoglutarate+O2aFlavonol+succinate+CO2+H2O。本實(shí)驗(yàn)采用PCR的方法，在苦蕎黃酮醇合酶基因(FtFLS)ORF起始密碼子前引入I酶切位點(diǎn)，去掉終止密碼并引入I酶切位點(diǎn)?？寺∫朊盖形稽c(diǎn)后的FZFLS到表達(dá)載體pET-30b(+)質(zhì)

5、粒屮，其表達(dá)產(chǎn)物分別在N-末端和C-末端各含有6xHis標(biāo)簽。重組質(zhì)粒(pET-30b⑴-FVfZS)經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.⑺//BL21(DE3)并使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)0h、2h、4h、6h和8h的產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE后用于考馬斯亮藍(lán)R-250染色或Westernblotting分析。Westernblotting的標(biāo)準(zhǔn)流程如卜：蛋白質(zhì)首先通過(guò)SDS-PAGE胺凝膠電泳分離，通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物上(硝酸纖維素膜、PVDF膜和尼龍膜)；將膜上未反應(yīng)的位點(diǎn)封W起來(lái)，以抑制抗體的非特異性吸附，固定的蛋白質(zhì)

6、即付與特異性的多克隆或單兌隆抗體相互作用并通過(guò)放射、生色或化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行定位。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體(Anti-HistagIgG,—抗)與重組FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6xHis發(fā)生抗原-抗體特異反應(yīng)，再利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(peroxidase-GoatAnti-MouseIgG，二抗)與一抗發(fā)生特異結(jié)合，最后使用DAB進(jìn)彳/?顯色。DAB即：二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine),是過(guò)氧化物酶(Peroxidase)的生色底物。DAB在過(guò)氧化氫的存在下失去電子而

7、呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。該方法常用于檢測(cè)過(guò)氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好，在免疫組化，原位雜交，Westernblotting等膜顯色中應(yīng)用廣泛。樹(shù)1.SDS-PAGE原理示意圍圖2.Westernblotting原理示意圖4.操作步驟4.1樣品的制備原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)大腸桿菌重組蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。材料與試劑：重組pET-30b(+)-F7FLS質(zhì)粒、表達(dá)宿主菌￡.⑺//BL21(DE3)、LB固體培養(yǎng)基(

8、Kan50pg/mL)、LB液體培養(yǎng)基(10mL、50mL)、Kan(50mg/mL)、IPTG(24mg/mL)、PBS緩沖液、5XSDS上樣緩沖液。儀器與設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、灑精燈、消毒酒精(75%)、棉球、接種環(huán)、臺(tái)式離心機(jī)、冰盤(pán)、Tip(10pL、