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1、Western-Blot操作流程試劑配制（一）母液1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g蒸餾水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。PHHCl7.4約17ml7.5約16m7.6約15ml8.0約10ml1.74mg/ml(10mmol/L)PMSFPMSF0.174g異丙醇100ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，-20℃保存。0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸餾水至500ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4
2、·12H2O（MW358.14）71.6g蒸餾水至1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。10％SDSSDS10g蒸餾水至100ml50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％過硫酸胺（AP）過硫酸胺0.1g超純水1.0ml溶解后，4℃保存，保存時(shí)間為1周。（可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中，一次性多裝幾管，使用時(shí)加入超純水即可）1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)45.43g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。0.5mol/LTris·HCl（pH6.8
3、）Tris(MW121.14)15.14g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr）37.5g甲叉雙丙稀酰胺（Bic）1g超純水至100ml溶解后4℃保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。20％Tween20Tween2020ml蒸餾水至100ml混勻后4℃保存。（二）使用液單去污劑裂解液（PMSF）：1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5mlNaCl0.438gTritonX-1000.5ml蒸餾水至50ml混勻后4℃保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100μg/ml（0.87ml
4、裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。（一般實(shí)際用的比較多的其實(shí)是RIPA裂解配方：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS。至于其中每個(gè)要加多少量那就自己去算吧，因?yàn)楸救艘呀?jīng)算好的配方表無意間弄丟了）0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）0.2mol/LNaH2PO419ml0.2mol/LNa2HPO481mlNaCl17g蒸餾水至2000ml（如果用TBST進(jìn)行洗膜的話，其實(shí)PBS用得很少，大可不必自己配制，向試劑公司購買20×的PBS濃縮液即可，500ml的濃
5、縮液不到50元，很方便）G250考馬斯亮藍(lán)溶液（蛋白定量專用）考馬斯亮藍(lán)G250100mg95％乙醇50ml磷酸100ml蒸餾水至1000ml配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4℃保存。0.15mol/LNaClNaCl（MW58.44）0.877g蒸餾水至100ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/LNaCl1ml溶解后-20℃保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0.15mol/LNaCl進(jìn)行100倍稀釋成1mg/ml，-20℃保存。10％分離膠和4％濃縮校10％分離膠（兩塊膠，10ml）4％濃縮膠（兩
6、塊膠，5ml）超純水4.85ml3.16ml40％Acr/Bic（37.5：1）2.5ml0.5ml1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－1.26ml10％SDS100μl50μl10%AP（過硫酸胺）50μl25μlTEMED5μl5μl加TEMED后，立即混勻即可灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據(jù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)時(shí)的溫度適當(dāng)調(diào)整）還原型5XSDS上樣緩沖液0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS0.5g溴酚藍(lán)0.
7、025甘油2.5ml混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。電泳液緩沖液Tris（MW121.14）3.03g甘氨酸（MW75.07）18.77gSDS1g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次。（電泳液可以回收重復(fù)利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鮮的電泳緩沖液）（可以配制成10×電泳液緩沖液進(jìn)行保存，稀釋10倍使用）轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸（MW75.07）2.9g
