western-blot 通用配方

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1、1.WesternBlotting相關(guān)溶液及抗體1)轉(zhuǎn)膜緩沖液（runningbuffer）(10×)(1L)Tris30.3g甘氨酸144g不調(diào)pH轉(zhuǎn)膜工作液（1×)(1L)（現(xiàn)配現(xiàn)用）(10×)轉(zhuǎn)膜緩沖液（runningbuffer）100ml無(wú)水乙醇100ml水800ml2)TBS緩沖液(5×)（1L）Tris-HCl12.15gNaCl146.4g用36-37%濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至約7.4（約5ml濃鹽酸，pH試紙檢測(cè)即可）TBST：TBS+Tween-200.1%（1mlfor1L）3)封閉液T

2、BST緩沖液中加入5%脫脂奶粉或者(3%Gelatine)4）WesternBlotting第一抗體適合于自己蛋白的抗體5）WesternBlotting第二抗體辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.實(shí)驗(yàn)步驟（1）SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)：(濃縮膠70V，30-40min；分離膠120V，1h)12%分離膠配方:5ml10ml15ml水1.63.34.930%丙烯酰胺2461.5MTrispH8.81.32.53.810%SDS0.050.10.1510%過(guò)硫酸銨（最后加）0.050.

3、10.15TEMED0.0020.0040.0065%濃縮膠1ml2ml3ml4ml水0.681.42.12.730%丙烯酰胺0.170.330.50.671.0MTrispH6.80.130.250.380.510%SDS0.010.020.030.0410%過(guò)硫酸銨（最后加）0.010.020.030.04TEMED0.0010.0020.0030.0045×loadingbuffer:4mlddH2O1.76ml1MTris-HClpH6.80.24ml甘油1ml10%（w/v）SDS0.8ml?

4、-巰基乙醇0.2ml（2）將4張濾紙剪成與海棉大小一致的方形（3）配（1×)轉(zhuǎn)膜工作液(10×)轉(zhuǎn)膜緩沖液（runningbuffer）80ml無(wú)水乙醇80ml水640ml800ml（4）將膠泡在（1×)轉(zhuǎn)膜工作液中（防止膠干掉，最好不要用水，水泡膠會(huì)漲）（5）用尺子量膠大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在無(wú)水乙醇中泡約1min,然后泡到（1×)轉(zhuǎn)膜工作液中。（PDVF膜為疏水性的，先在乙醇中泡會(huì)使其親水性好）（7）將海綿和濾紙?jiān)谒薪?，然后按照一下順?整個(gè)操作過(guò)程中保

5、證膜不能干)：白板—海綿—兩層濾紙--PDVF膜（靠正極）--膠（靠負(fù)極）（用小試管排氣泡）--兩層濾紙—海綿（用小試管排氣泡）--夾住—放入膠槽中（白板靠紅，黑板靠黑，保證電極方向不要錯(cuò)）--在膠槽中加入轉(zhuǎn)子—倒入（1×)轉(zhuǎn)膜工作液—在膠槽中放入冰袋—80V～100V恒壓，60min(該條件可以轉(zhuǎn)移25kD～90kD的蛋白)(8)封閉：在封閉液中室溫，搖1h或者4℃靜置過(guò)夜。（9）漂洗：將PVDF膜在TBST緩沖液中漂洗3次，每次10分鐘；(10)一抗：適量的一抗加到TBST+脫脂奶粉(或者是TBST

6、+1%Gelatine)室溫?fù)u1h.(11)漂洗：將PVDF膜在TBST緩沖液中漂洗3次，每次10分鐘(12)二抗：適量的二抗加到TBST+脫脂奶粉(或者是TBST+1%Gelatine)室溫?fù)u1h.（13）漂洗：將PVDF膜在TBST緩沖液中漂洗3次，每次10分鐘兩種顯帶方式：曝光法（14）用紙將PVDF膜上的水分吸干，然后將將PVDF膜放在保鮮膜上，將ECL試劑盒中的A液和B液按照1：1的比例混勻（見說(shuō)明書）后均勻覆蓋到PVDF膜上1min,然后用紙將PVDF膜上的溶液吸干，放入X光片的暗盒中。（1

7、5）在暗室中，使用紅光燈，將顯影液，水，定影液分別倒入三個(gè)盤子中，然后取出X光片剪成合適大小，放入含有PVDF膜的暗盒中，曝光一定時(shí)間后取出X光片，放入顯影液中顯影，檢測(cè)顯影的情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)X光片中有條帶時(shí)，放入水中清洗光片，然后在定影液中定影。然后在黑暗情況下將光片和顯影液定影液收好。顯影液和定影液應(yīng)為無(wú)色透明，若發(fā)現(xiàn)顏色異常、有沉淀或長(zhǎng)菌需重配。膜上顯色法：（14）增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒；包括1×HRP緩沖液，試劑A，試劑B和試劑C，三者添加的體積比為1ml1×HRP緩沖液+50μl試劑A

8、+50μl試劑B+50μl試劑C。顯色劑體積依照個(gè)人的需要配置。將PDVF膜置于顯色劑中，暗處?kù)o置8-10min，接著用水沖洗以終止反應(yīng)，然后將紙吸干PDVF膜上殘余的水，掃描儀掃圖即可。