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《Western-blot試驗(yàn)技術(shù)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、Western-blot試驗(yàn)技術(shù)概論它結(jié)合了凝膠分辨力高和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，與免疫沉淀法比較，這種方法無需對(duì)靶蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記。幾乎總在變性條件下進(jìn)行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題。具有從混雜抗原中檢測(cè)出特定抗原，或從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的優(yōu)越性，還可以對(duì)轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行連續(xù)分析，具有蛋白質(zhì)反應(yīng)均一性，固相膜保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。被廣泛地用于蛋白質(zhì)研究，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。溶解蛋白策略1使用劇烈的條件以確保細(xì)胞蛋白能全部裂解下來，但這可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)性的丟失。2采用溫和的條件以助于保持
2、蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)，但這造成蛋白質(zhì)從細(xì)胞上的脫落效果欠佳。機(jī)械破碎細(xì)胞，可釋放出蛋白酶從而使靶蛋白降解。細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白通常比細(xì)胞內(nèi)蛋白具有更好的抵抗力，變性蛋白比天然蛋白更容易降解。往往可以根據(jù)靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性質(zhì)來調(diào)整提取的條件。為盡可能減少可能出現(xiàn)的問題，可設(shè)法采用多克隆抗血清或多種單克隆抗體的混合物，因?yàn)樗麄兛膳c某一蛋白的多種形式起反應(yīng)。溶解方法溶解方法取決于細(xì)胞的型別和待測(cè)抗原的性質(zhì)：1表達(dá)靶蛋白的細(xì)菌一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。2酵母先用玻璃珠振蕩法或酶法裂解細(xì)胞，然后制備提取液。3哺乳動(dòng)物組織通?？梢詸C(jī)械分散并
3、直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。4哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用去污劑溫和裂解。如果靶抗原耐受相應(yīng)抽提過程，也可在SDS凝膠加樣緩沖液裂解。細(xì)胞準(zhǔn)備用PBS洗兩次細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用橡膠刮子刮下細(xì)胞，由于染色體DNA的釋放，溶液變得很粘稠。吸入1.5ml離心管。超聲打碎染色體DNA,直至溶液不粘為止。4度，13000rpm，30分鐘離心。分成三層：上層為油脂，中層為蛋白質(zhì)，下層為沉淀。有必要時(shí)重復(fù)上一步驟。上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可將上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf-80°C保存注意事項(xiàng)細(xì)胞裂解液的量超聲的頻率，時(shí)間，次數(shù)。插得深不起泡沫。檢測(cè)蛋
4、白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一個(gè)孔大約上100ug的總蛋白。只要被檢測(cè)蛋白占總蛋白的1/100000,即可被檢測(cè)。未知蛋白應(yīng)同時(shí)作陽性對(duì)照。主要試劑RIPA（華舜公司）苯甲基磺酰氟PMSF（華舜公司）丙烯酰胺（Amresco公司）雙丙烯酰胺（Amresco公司）麗春紅染料（華舜公司）Tween20（Amresco公司）過硫酸銨（Sigma公司）四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司）硝酸纖維素膜（Amersham公司）考馬斯亮蘭（Fluka公司）兔抗大鼠Glut1多克隆抗體（SantaCruz公司）Phototope-HR
5、PWesternBlotDetectionSystem（CellSignalingTechnology公司）儀器與設(shè)備低溫超速離心機(jī)（Eppendorf公司）分光光度計(jì)（Eppendorf公司）Thermomixer（Eppendorf公司）電泳儀（Bio-Rad公司）垂直式電泳槽（Bio-Rad公司）硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-Rad公司）配制試劑10×電泳Buffer稱取Tris-base30.3克glycine144克加去離子水，定容至1000mlSDS10克1.5MTris.HClPH8.8稱取18.15克Tris，加60mlddH2O溶解
6、，調(diào)PH至8.8，定容100ml0.5MTris.HClPH6.8稱取6.0克Tris，加60mlddH2O溶解，調(diào)PH至6.8，定容100ml轉(zhuǎn)膜緩沖液稱取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，臨用前加200ml甲醇10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。配制試劑30％Acry-Bis29克丙烯酰胺＋1克雙丙烯酰胺，加ddH2O100ml配成，避光4℃保存10％過硫酸胺，新鮮配制，<1week0.1克過硫酸胺加ddH2O1ml配成，4℃保
7、存封閉試劑10×TBS（應(yīng)用液：1×TBS）10×TBS：取24.2克Tris－Base80克氯化鈉用800mlddH2O溶解后，用HCl調(diào)PH至7.6，定容至1000ml1×TBS：取10×TBS50ml，稀釋至500ml，臨用前加0.1％Tween20，500ul。配制試劑4×SDSSampleBuffer2.4克TrisHCL，溶解在30ml水中，調(diào)pH6.88克SDS0.4克溴酚蘭定容至100ml40ml甘油10mlDTT貯存液1mol/LDTT貯存液：0.01mol/L乙酸鈉20ml3.09克DTT過濾除菌后-20℃保存，分裝成1ml?？捡R
8、斯亮蘭染液：45ml甲醇45ml水用Whatman濾紙過濾，去除顆粒狀物質(zhì)10ml冰乙酸0.25克考馬斯亮蘭
