淀粉酶活測定

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1、α－淀粉酶活力的測定?一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握α-淀粉酶活力測定的基本原理、方法和操作技能。二、實(shí)驗(yàn)原理α-淀粉酶能將淀粉分子鏈中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對碘呈藍(lán)紫色的特異性反應(yīng)逐漸消失，呈紅棕色，其顏色消失的速度與酶活力有關(guān)，故可通過固定反應(yīng)后的吸光度計算其酶活力。三、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器（一）試劑1.原碘液稱取碘（I2）11g，碘化鉀（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，貯于棕色瓶中。2.稀碘液吸取原碘液2.00m

2、L，加碘化鉀20g，用水溶解并定容至500mL，貯于棕色瓶中。3.20g／L可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉（以絕干計）2000g．精確至0.001g，用水調(diào)成漿狀物．在攪動下緩緩傾入70mL沸水中。然后，以30mL水分幾次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液并入其中，加熱至完全透明，冷卻，定容至100mL。此溶液需要當(dāng)天配制。注：采用浙江菱湖食品化工聯(lián)合公司生產(chǎn)的可溶性淀粉。4.磷酸緩沖液（pH6.0）稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）45.23g、檸檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容

3、至1000mL。配好后用pH計校正。（二）儀器1.分光光度計應(yīng)符合GB9721的有關(guān)規(guī)定2.秒表3.恒溫水?。?0±0.2）℃4.試管25mm×2000mm四、實(shí)驗(yàn)步驟1.待測酶液的制備稱取酶粉l-2g，精確至0.0002g（或吸取液體酶100mL），先用少量的磷酸緩沖液溶解，并用玻璃攪拌棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此搗研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（將估計酶活力除以4，即酶活力應(yīng)在3.7-5.6IU／mL范圍內(nèi)），搖勻。通過4層紗布過濾，濾液

4、供測定用。2.測定（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于試管中，加入緩沖液5.00mL，搖勻后，于（60±0.2）℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。（2）加入稀釋好的待測酶液1.00mL，立刻記時，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min。（3）立即吸取反應(yīng)液1.00mL于稀碘液5.00mL中，搖勻，并以稀碘液作空白，于660nm波長下，用10mm比色皿，迅速測定其吸光度（A）。根據(jù)其吸光度查表，求得測試酶液的濃度（C）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果整理樣品酶的活力根據(jù)以下公式計算：X=c×n式中：X－樣品的酶活力[IU/g(IU/mL)]

5、c－樣品酶液的濃度(IU/mL)n－樣品的稀釋倍數(shù)所得結(jié)果表示至整數(shù)。平行實(shí)驗(yàn)相對誤差不得超過2%。本文研究了麥芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖等作為碳源在不同濃度下對枯草芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶活力、細(xì)胞生物量及其培養(yǎng)基pH值的影響。結(jié)果表明:乳糖濃度為3%時,酶活力最高,為90.6±0.7U/mL。麥芽糖濃度為2%時,酶活力最高,為67.2±0.6U/mL;果糖濃度為4%時,酶活力最高,為38.0±3.7U/mL;葡萄糖濃度為4%時,酶活力最高,為23.2±0.3U/mL;蔗糖濃度為4%時,酶活力最高

6、,為24.7±0.5μ/mL。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生α-淀粉酶可能受乳糖的誘導(dǎo),受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用。發(fā)酵液前后的pH值沒有顯著的差異。細(xì)胞生物量也差別不大。該研究為進(jìn)一步提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)中溫α-淀粉酶酶活,提供了實(shí)踐及理論意義。α-淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱,其系統(tǒng)名稱為α-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,是一種內(nèi)切淀粉酶。它可以隨機(jī)的方式切斷淀粉分子內(nèi)的α-1,4葡萄糖苷鍵,生成糊精和還原糖。α-淀粉酶是目前世界上較早生產(chǎn)、產(chǎn)量較大的工業(yè)酶制劑之一,在食品、紡織、醫(yī)藥和飼料等工業(yè)中都有測定

7、時注意事項(xiàng)：1．底物濃度除選擇適合的底物外，在實(shí)際應(yīng)用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應(yīng)速度V成雙曲線關(guān)系，在酶活性測定時，要求[S]達(dá)到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10～20Km為宜，此時反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度，測定的誤差在可接受范圍。2．酶濃度在反應(yīng)條件一定時，酶濃度與反應(yīng)速度成正比。按照中間產(chǎn)物學(xué)說，只有[S]>>[E]時，酶才能被底物分子飽和，反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值。因此當(dāng)標(biāo)本酶活力過高時，應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后再加以測定。3．溫度不同的酶最適溫度可以不同，

8、多數(shù)酶的最適溫度在37～40℃，高于或低于最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測定溫度尚未統(tǒng)一，但常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多使用37℃。溫度對酶促反應(yīng)的影響程度通常用溫度系數(shù)(Q10)表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃，化學(xué)反應(yīng)速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l～2。由溫度系數(shù)得知，溫度的變化對酶活性有著重要影響，因此要求酶活性測定要在恒溫條件下進(jìn)行，溫度波動要控制在±1℃。4．離子強(qiáng)度和pH值在最適pH時，酶的活性最強(qiáng)，高于或低于最適pH，酶的活性都降低，多數(shù)酶的最適pH在5～8之間