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1、海人藻酸致癇大鼠心肌細(xì)胞ERK表迖實(shí)驗(yàn)探究[摘要]目的研究海人藻酸致癇大鼠心肌細(xì)胞ERK表達(dá)情況。方法采用立體定位儀下杏仁核內(nèi)注射海人藻酸方法制備癲癇動物模型,在大鼠癲癇發(fā)作后不同時(shí)程,快速制備心臟組織標(biāo)本,進(jìn)行免疫組化及染色,用Image_ProPlus像分析軟件,計(jì)算大鼠心肌細(xì)胞ERK表迗灰度值的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,觀察不同時(shí)程心肌細(xì)胞ERK表迖情況。結(jié)果致癲癇組大鼠心肌細(xì)胞ERK表達(dá)于癲癇發(fā)作后1/2小時(shí)開始增加,灰度值為4735.86±172.43,2小時(shí)心肌組織ERK的表達(dá)迗到高峰,灰度值為12764.71±178.45,與對
2、照組相比P值均<0.05,隨后逐漸下降;至癲癇發(fā)作6小時(shí),心肌組織ERK表達(dá)基本消失,灰度值為2389.78±185.64,與對照組相比P〉0.05。結(jié)論ERK在癲癇所引起的腦心綜合征中有表迗[關(guān)鍵詞]癲癇;心肌細(xì)胞;細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶中圖分類號:R54文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1009_816X(2008)01_0015_03引起腦心綜合征的原因很多,顳葉癲癇是最常見之一但國內(nèi)關(guān)于顱內(nèi)疾患所致的腦心綜合征的報(bào)導(dǎo),少有由癲癇引起腦心綜合征的臨床報(bào)道。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)作為胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),在海人藻酸(KA)致癇模型中以及
3、在心血管系統(tǒng)中均有重要意義,然而MAPK在癲癇引發(fā)腦心綜合征中是如何發(fā)揮作用,尚無公認(rèn)的定論。有研究報(bào)道,在KA側(cè)腦室內(nèi)注射致癇模型中,癇性發(fā)作l/2h后ERK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶)、JNK、p38均升高,ERK持續(xù)升高約3h,而JNK和p38在2h后即恢復(fù)正常[1],本文對ERK在癲癇所引起的腦心綜合征中的表達(dá)進(jìn)行探討。1材料與方法1.1主要儀器和試劑:動物大腦立體定位儀(BUNKY0_KV113T0KY0)_日本;LMS_2B型二道生理記錄儀_成都。MAPK1/2(抗體)及KA購自美國sigma公司。1.2動物分組:實(shí)驗(yàn)動物選
4、用健康雄性Wistar大鼠42只,體重約250克,均購自吉林大學(xué)新民校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物部,其中正常對照組大鼠7只,致癇組大鼠35只,按海人藻酸致癇后癲癇發(fā)作即刻、1/2小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)及6小時(shí)分為5組,每組各7只。1.3模型建立:將KA溶解在PBS中性緩沖液中,配制成濃度為1毫克/毫升的液體。用10%水合氯醒0.33ml/kg體重腹腔麻醉大鼠。將大鼠兩外耳道固定于立體定位儀上,并將水平線調(diào)零。取頭顱正中菱形切口,暴露顱骨及前囟、后囟,將立體定位儀正中線調(diào)零。右側(cè)杏仁核基底外側(cè)核的坐標(biāo)位置為前囟后2.5mm,旁開5.Omm,煩骨表面下
5、8.0mm。用小牙鉆鉆透頂骨至硬腦膜處,一部分動物在KA注射前,預(yù)先在左側(cè)海馬CA3區(qū)包埋雙極電極。按照上述右側(cè)杏仁核坐標(biāo),注入海仁藻酸lul,空白組為生理鹽水lul,注藥后留針約5min左右,緩慢退出。然后,縫合切口,將大鼠放在敞口有機(jī)玻璃罩中,按Racine分級法,將大鼠行為分為以下5級:0級_正常行為狀態(tài);I級:濕狗樣顫動,面部痙攣抽動,包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼等;II級:I級加節(jié)律性點(diǎn)頭;III級:II級加前肢痙攣;IV級:站立并伴雙側(cè)前肢痙攣;V級:持續(xù)站立、傾倒、失平衡、四肢抽動。達(dá)到以下兩個(gè)條件為模型成功。①按Ra
6、cine標(biāo)準(zhǔn)分級,大鼠致癇后出現(xiàn)III級以上發(fā)作;②鼠海馬深部電極腦電圖出現(xiàn)正常波上棘波和尖波放電。1.4免疫組化及染色:分別于大鼠癲癇發(fā)作后即刻、l/2h、2h、4h及6h后,以10%水合氯醛麻醉大鼠,快速取心臟標(biāo)本,置于10%中性緩沖福爾馬林固定液中1.5小時(shí)后,棄去固定液,準(zhǔn)備酒精脫水、石蠟包埋及免疫組化及染色。切片經(jīng)HE染色后拍照,在顯微鏡下放大20倍后再拍照,每張切片選取10個(gè)視野,選定其中某一細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn),用Image_ProPlus圖象分析軟件測定心肌組織ERK表達(dá)的灰度值。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x_±s表
7、示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組間比較采用方差分析,成組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1海人藻酸致癇大鼠的海馬深部電極腦電改變正常大鼠腦電波形,頻率以5?10赫茲為主,波幅小于700Mv,見圖1。KA注射后各組大鼠腦電波均出現(xiàn)多種形式的癲癇性放電。典型波形有單棘波、多相棘波、雙相棘波、棘慢波、尖波發(fā)作性節(jié)律波、發(fā)作后抑制等,見圖2。2.2致癲組大鼠心肌細(xì)胞不同時(shí)程ERK表迗的病理學(xué)改變,見圖3?7。2.3致癇組大鼠心肌細(xì)胞不同時(shí)程ERK表迗的灰度值測定:見表1。3討論心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián),正常情況下腦通過自
8、主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)心臟活動而維持一種穩(wěn)態(tài),當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變時(shí)會打破這種穩(wěn)態(tài)。MAPK是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)酶家族。其成員ERK與細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡,甚至保護(hù)作用有關(guān)。心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞的一種程序性細(xì)胞死亡,它在心臟的正常發(fā)育過程中及心