櫛孔扇貝(chlamys+farreri)單核苷酸多態(tài)性(snp)標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

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1、櫛孑L扇貝(Chlamysfarreri)單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用摘要單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolyrnorphism，SNP)是由單堿基顛換、轉(zhuǎn)換引起的DNA序列變異，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1％。SNP以其位點(diǎn)豐富、有代表性、遺傳穩(wěn)定、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為繼限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)和簡單重復(fù)序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)后的第三代分子標(biāo)記，在遺傳學(xué)分析中得到廣泛應(yīng)用。現(xiàn)有的SNP開發(fā)技術(shù)

2、有很多，本研究中主要采用高分辨率熔解曲線(H蹦)和高通量測序技術(shù)開發(fā)基因區(qū)SNP標(biāo)記并且進(jìn)行群體多樣性和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建研究。1．櫛孔扇貝基因區(qū)SNP標(biāo)記的開發(fā)以及群體遺傳學(xué)研究本實(shí)驗(yàn)室已對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行454高通量測序，得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，生物信息學(xué)分析得到大量的候選g妲_馘，．．鼻：用高分辨率熔解曲線非標(biāo)記探針技術(shù)對候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測和分型，實(shí)現(xiàn)櫛孔扇貝SNP標(biāo)記的快速開發(fā)。本研究中首先設(shè)計(jì)了150組引物，其中103組引物成功擴(kuò)增。利用非標(biāo)記探針結(jié)合熔解曲線，共篩選SNP位點(diǎn)51個(gè)，并且對榮成群體48個(gè)個(gè)體進(jìn)行群體多樣性的初步研究

3、；51個(gè)SNP位點(diǎn)中有49個(gè)呈現(xiàn)多態(tài)性，最小等位基因頻率在0．0610-0。5000之閭，．觀朔4雜合度租期望雜合度分別在0．0833．0．8889和0．0833．0．5833。除2個(gè)位點(diǎn)外其余都符合哈迪．溫伯格平衡(P

4、個(gè)全同胞家系作為研究對象，在HRM分型的SNP信息的基礎(chǔ)上，稠MultiSNP技術(shù)，結(jié)合SOLID測序得到大量的SNP位點(diǎn)分型信息，從而構(gòu)建了櫛孔扇貝整合遺傳連鎖圖譜。共設(shè)計(jì)了引物1300組，將300或350組引物等量混合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過SOLiD測序，得對S陽不同基因型。構(gòu)建的櫛孔扇貝整合的圖譜中，362個(gè)標(biāo)記共被劃分為19個(gè)連鎖群，每個(gè)連鎖群的SNP標(biāo)記數(shù)目從8．33個(gè)不等，連鎖群標(biāo)記數(shù)最多的是2號(hào)連鎖群，共33個(gè)SNP標(biāo)記，連鎖群標(biāo)記數(shù)目最少的是19號(hào)連鎖群，共8個(gè)SNP標(biāo)記數(shù)，平均每個(gè)連鎖群有19個(gè)標(biāo)記；圖譜標(biāo)記的平均間隔為5．0cM，其中10個(gè)連鎖群的平均間隔小于

5、5．0cM，16號(hào)連鎖群的平均間隔最小，為3．5cM；連鎖群的大小范圍為42．8cM．142．1cM，整合圖譜長度為1825．1eM，利用第一種估算方式，整合后圖譜的預(yù)期長度為2015．1cM，利用第二種估算方式，整合后圖譜的預(yù)期長度為2035．7cM，兩種方式的平均值為2025．4cM，圖譜覆蓋率為90％。在櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組454高通量測序的基礎(chǔ)上，依據(jù)預(yù)測的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，分別利用高分辨率熔解曲線非標(biāo)記探針技術(shù)和MultiSNP方法驗(yàn)證和分型SNP，同時(shí)構(gòu)建了SNP遺傳連鎖圖譜，為櫛孔扇貝QTL定位，分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：櫛孔扇貝(Chlamysfar

6、reri)；單核苷酸多態(tài)性；高分辨率熔解曲線；遺傳連鎖圖譜Developmentandapplicationofsinglenucleotidepolymorphism(SNP)markersinZhikongscallop(Chlamysfa珊廠力Abs仃actSingleNucleotidePolymorphism(SNP)isaDNAsequencevariationcausedbynucleotidessubstitution，deletionorinsertion，andtheminorallelefrequency(MAY)isnolessthan1％inth

7、epopulation．Becauseofhighdensitycoverage，typicalrepresentativeness，stableheredity,easydetectionandautomaticalanalysis，SNPisrecognizedasthet11irdgenerationofmolecularmakorsafterRFLPandSSRandbeenwidelyusedingeneticanalysis．Nowadays，therearemanymethodsofSNPdevelopment．