8基因工程菌發(fā)酵

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1、第八章基因工程菌培養(yǎng)?基因工程菌生產(chǎn)的主要產(chǎn)品有二類：?非蛋白質(zhì)，通過代謝工程細(xì)胞來獲得，這些細(xì)胞插入編碼酶的DNA，產(chǎn)生新的途徑或增強某一途徑，從而得到新的化合物或增加產(chǎn)量。?蛋白質(zhì)，現(xiàn)代基因工程重點一些正在開發(fā)或已開始生產(chǎn)的DNA重組技術(shù)產(chǎn)品食品氨基酸及飼食品加工酶料添單細(xì)胞蛋白加劑農(nóng)業(yè)植物品種改良（包括增加產(chǎn)量，提高蛋白質(zhì)含量，改進(jìn)抗逆性能，具有固氮能力等）生物殺蟲劑化工用生物物質(zhì)生產(chǎn)甲烷、甲醇、乙醇、丙酮-丁醇、多元醇、有機(jī)酸等及能用于化學(xué)品或生物物質(zhì)（如纖維素）轉(zhuǎn)化所需要的酶源原用生物催化方法生產(chǎn)環(huán)氧烷烴、聚羥基丁酸酯（PHB）等料用

2、藻類生產(chǎn)碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)生產(chǎn)黃原膠等粘性物質(zhì)（以提高油井的采油量）環(huán)境高效生物降解或解毒菌種保護(hù)美國批準(zhǔn)生產(chǎn)的主要生物技術(shù)治療藥物通稱商品名生產(chǎn)公司用途1988年銷售額5美元）（10人胰島素HumulinEliLilly治療糖尿病115人生長激素ProtropinGenentechNovo治療兒童生長150HumareopeEliLilly發(fā)育不良α-干擾素IntronASchering-Plougn治療毛細(xì)胞78～80ReferonAHoffmanLa白血病Roche乙型肝炎疫苗Merck防治乙肝低于30組織血纖維蛋ActivaseG

3、enentech治療心臟病突170白溶酶激活發(fā)癥劑——TPA抗T-細(xì)胞單克OrthocloneOrtho治療腎移植抗低于15隆抗體OKT-3異一、基因工程菌培養(yǎng)的特點?是外源蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的異源表達(dá)，不同于微生物的天然次級代謝藥物，因此在調(diào)控合成方式上，應(yīng)該主要受限于質(zhì)?；蚴删w的內(nèi)在性質(zhì)；?是蛋白質(zhì)產(chǎn)物，不同于種類多樣的次級代謝產(chǎn)物；?合成途徑簡單，沒有復(fù)雜的多酶系統(tǒng)；?產(chǎn)物的積累主要在胞內(nèi)，分泌型也主要積累在細(xì)胞周質(zhì)中；?產(chǎn)物在胞內(nèi)積累通常是以包涵體的形式；?分離純化相對于次級代謝產(chǎn)物而言要簡單、一致；?產(chǎn)物分離純化后可能沒有活性，需要進(jìn)

4、一步的復(fù)性?；蚬こ趟幬锸寝D(zhuǎn)基因產(chǎn)品，具有潛在的危險，因此對產(chǎn)生菌的管理要求嚴(yán)格，應(yīng)該避免各種可能的擴(kuò)散污染，必須在合格的GMP生產(chǎn)車間進(jìn)行?；蚬こ趟幬锏腉MP是對生產(chǎn)全過程的質(zhì)量管理，涉及人員、廠房、設(shè)備，原材料采購入庫、檢驗、發(fā)料、加工、制品及半成品檢驗、分包裝，成品檢定，產(chǎn)品銷售、運輸，用戶意見及使用反應(yīng)處理等在內(nèi)的全過程的質(zhì)量管理。二、基因工程藥物制造的一般流程（1）獲得目的基因；（2）組建重組質(zhì)粒；上游階段（3）構(gòu)建基因工程菌；（4）培養(yǎng)工程菌；（5）產(chǎn)物分離純化；（6）除菌過濾；下游階段（7）半成品檢定；（8）包裝?1、上游階段：

5、首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將其插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)粒或噬菌體中并轉(zhuǎn)大腸桿菌或其它宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。其中的（1）、（2）、（3）步驟屬于上游階段，在實驗室完成。?2、下游階段：將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)大的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度純品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機(jī)的優(yōu)化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（

6、7）、（8）等屬于下游階段。三、宿主-載體系統(tǒng)?宿主的選擇主要考慮產(chǎn)物的活性表達(dá)和宿主的安全性。如果用于食品要考慮宿主菌是否列入FDA表中，列入的認(rèn)為是安全的菌。?一般的原則是根據(jù)所用的載體體系及各種受體細(xì)胞的基因型進(jìn)行選擇，要使重組體的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染效率高、能穩(wěn)定傳代、受體細(xì)胞基因型與載體所含的選擇標(biāo)記需匹配。1、原核細(xì)胞（1）大腸桿菌：目前采用最多的原核表達(dá)體系。（2）枯草芽孢桿菌（3）鏈霉菌2、真核細(xì)胞（1）酵母：釀酒酵母應(yīng)用廣泛。（2）絲狀真菌（3）哺乳動物細(xì)胞（4）植物細(xì)胞四、基因工程菌發(fā)酵1、培養(yǎng)過程?通過搖瓶操作了解工程菌生長的基礎(chǔ)條

7、件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分拆表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響；?通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序。2、培養(yǎng)方式?（1）補料分批培養(yǎng)?將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方式。?（2）連續(xù)培養(yǎng)?將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定濃度后，開動進(jìn)料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。?（3）透析培養(yǎng)?利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其生產(chǎn)菌的不利影響。?（4）固定化培養(yǎng)釀酒酵母的高密度培養(yǎng)及人

8、免疫干擾素的表達(dá)?人α2α型干擾素（IFN-α2α）是國外已大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的抗病毒及抗腫瘤多肽藥物。?它是由165個氨基酸組成的單鏈多肽，相對分子