蛋黃測(cè)定 文檔

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1、蛋黃中膽固醇含量測(cè)定方法的研究膽固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等試劑盒法是基于酶法測(cè)定膽固醇的原理進(jìn)行的比色法一種依據(jù)顯色反應(yīng)來分析的傳統(tǒng)方法色譜法是適用范圍較廣、靈敏度較高的分析方法而高效液相色譜不需要載氣在使用上較氣相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法簡便[6-11]。本試驗(yàn)對(duì)液相色譜法、皂化-比色法和試劑盒法測(cè)定蛋黃膽固醇的過程和結(jié)果進(jìn)行研究和比較為雞蛋膽固醇含量測(cè)定工作提供方法指導(dǎo)。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料蛋黃由市售新鮮雞蛋中取出膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99.7%由中國計(jì)量科學(xué)研究院提供總膽固醇試

2、劑盒酶法由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供顯色液為FeSO4-冰乙酸-濃硫酸將Fe?SO4100mg溶于1mL蒸餾水中再加入100mL冰乙酸混合溶解然后與100mL濃硫酸緩慢混勻冷卻后使用。1.2試驗(yàn)方法1.2.1HPLC法取新鮮蛋黃稀釋液濃度為0.1g·mL-11.0mL于10mL離心管中加入95%乙醇1.0mL用漩渦振蕩器混勻后加入乙醚2.5mL再次混勻后加入石油醚2.5mL震蕩混勻3000rpm離心5min移出上層萃取液在低于45℃下用氮?dú)獯蹈杉訜o水乙醇溶解殘余物2.0mL用0.45μm有機(jī)微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。色譜條件為色譜柱ZOR

3、BAXEclipseXDB-C184.6mm×150mm5μm流動(dòng)相乙腈-異丙醇(4:1)V/V流速0.8mL·min-1柱溫35℃檢測(cè)波210nm進(jìn)樣量10μL。取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級(jí)無水乙醇溶解配成濃度為1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液取標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度0~1000μg·mL-1以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)峰面積值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用外標(biāo)法定量分析樣品中膽固醇含量。1.2.2皂化比色法稱取鮮蛋黃100mg于25mL試管中加入KOH-甲醇溶液5mL200g·L-1漩渦震蕩混勻置于80℃水浴恒溫振蕩器中皂化10min取出冷卻至室溫加入正己烷10mL漩

4、渦震蕩混勻靜置將上層液體移入10mL離心管中3000rpm離心10min取出上清液60℃下用氮?dú)獯蹈伞Ｈ缓蠹尤氡宜?mL溶解殘余物再加入顯色液3mL于60℃水浴15min在490nm下用722分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析同法做空白樣。將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配成1mg·mL-1溶液取不同體積膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品做同樣處理以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)吸光度值為縱坐標(biāo)制作工作曲線。根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算樣品中膽固醇含量。1.2.3試劑盒法樣品前處理方法同1.2.1根據(jù)試劑盒說明將樣品與工作液混合37℃保溫5min后在波長500nm處比色測(cè)定吸光度值并根據(jù)樣

5、品管和校準(zhǔn)管的吸光度值及校準(zhǔn)品濃度計(jì)算膽固醇含量膽固醇含量=測(cè)定管吸光度值校準(zhǔn)管吸光度值×校準(zhǔn)品濃度11.2.4加標(biāo)回收率的測(cè)定量取0.1g·mL-1新鮮蛋黃稀釋液0.5mL或新鮮蛋黃50mg加入1mg·mL-1的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液750μL按照上述3種方法進(jìn)行處理并分析根據(jù)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率。計(jì)算公式見式回收率=a-bc×100%（a為測(cè)得加標(biāo)樣中膽固醇的量、b為樣品中膽固醇的量、c為加標(biāo)量。）1.3數(shù)據(jù)處理采用Excel2007和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。2試驗(yàn)結(jié)果2.1HPLC法測(cè)定蛋黃膽固

6、醇含量樣品的高效液相色譜圖見附圖。由附圖可知膽固醇的保留時(shí)間為14.662min。2.2測(cè)定結(jié)果比較3種方法測(cè)定結(jié)果見附表。通過對(duì)3種方法的比較發(fā)現(xiàn)HPLC法的測(cè)定結(jié)果低于皂化-比色法但差異不顯著P>0.05而試劑盒法的測(cè)定結(jié)果較HPLC法高P<0.05這與Nogueira的結(jié)果相一致?！?2】目前我國產(chǎn)膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒其測(cè)定原理是膽固醇在膽固醇氧化酶的作用下生成膽甾烯酮再與氨基安替吡啉反應(yīng)生成紅色醌化物醌化物顏色深淺與膽固醇含量成正比試劑盒法測(cè)定結(jié)果較高的原因可能是蛋黃中固醇以外的甾醇類物質(zhì)也同氨基安替吡啉反應(yīng)生成有色

7、物使測(cè)定結(jié)果偏高[13]。HPLC法測(cè)定蛋黃膽固醇結(jié)果的偏差最小方法的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性也好于其他兩種方法因而HPLC法的精密度較高。皂化-比色法的偏差較大其原因可能是此法采用皂化、顯色等多步操作增加了由儀器、試劑和操作等方面帶來的系統(tǒng)誤差另外蛋黃中膽固醇以外的物質(zhì)也可能與硫酸反應(yīng)而生成有色物給測(cè)定結(jié)果帶來干擾。試劑盒法的精密度最低這可能與蛋黃樣品中干擾物質(zhì)較多有關(guān)。在樣品中加入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品分析加標(biāo)回收率的結(jié)果表明HPLC法的回收率最好因而準(zhǔn)確度最高皂化-比色法居中試劑盒法的準(zhǔn)確度最低。皂化-比色法的加標(biāo)回收率偏低可能與膽固醇皂化不完全有關(guān)皂化時(shí)間

8、短樣品中膽固醇未能被完全皂化但皂化時(shí)間長又可能會(huì)使樣品中增加膽固醇以外的皂化產(chǎn)物而干擾測(cè)定結(jié)果。試劑盒法的加標(biāo)回收率偏高一方面與甾醇干擾有關(guān)另一方