15 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)--琥珀酸脫氫酶的作用及丙二酸的抑制作用

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1、琥珀酸脫氫酶的作用及丙二酸的抑制作用【目的】1．掌握琥珀酸脫氫酶作用及丙二酸抑制作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理。2．深化理解酶的競爭性抑制作用的特點(diǎn)。【原理】肌肉組織含有的琥珀酸脫氫酶是一種結(jié)合蛋白酶，以FAD為輔基。它能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，F(xiàn)AD接受氫生成FAD·2H。體外實(shí)驗(yàn)以美藍(lán)(甲烯藍(lán))為受氫體，使美藍(lán)還原生成美白(甲烯白)。其反應(yīng)如下：琥珀酸脫氫酶活性越高，美藍(lán)脫色所需的時(shí)間越短，由于美白易被空氣中的氧氧化成美藍(lán)。故實(shí)驗(yàn)需在無氧條件下進(jìn)行，可加一層液體石蠟以隔絕空氣。丙二酸與琥珀酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似，能和琥珀酸競

2、爭與琥珀酸脫氫酶結(jié)合，從而抑制琥珀酸的脫氫作用。其抑制程度與抑制劑和底物二者的濃度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的琥珀酸和丙二酸來觀察丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制作用。【器材】1．研缽與剪刀2．漏斗3．紗布4．恒溫水浴【試劑】1．0.2mol/L琥珀酸溶液2．0.02mol/L琥珀酸溶液3．0.2mol/L丙二酸溶液4．0.02mol/L丙二酸溶液以上四種溶液均先用5mol/LNaOH溶液調(diào)至pH7.0，再用0.01mol/LNaOH溶液調(diào)至pH7.4。直接用琥珀酸鈉或丙二酸鈉配制亦可。5．1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH

3、7.4）1/15mol/LNa2HPO480.8ml與1/15mol/LKH2PO419.2ml混勻即可。6．0.02%美藍(lán)溶液7．液體石蠟【操作】1．肌肉提取液的制備取用蒸餾水清洗過的新鮮動物肌肉組織約10g，置于研缽（或勻漿器）中，研磨成糜狀，然后每克肌肉組織加4倍體積的冰冷的pH7.41/15mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻，用雙層紗布過濾，取濾液備用。2．酶促反應(yīng)取試管5支，編號，按下表操作。試劑（滴）12345肌肉提取液20202020-0.2mol/L琥珀酸溶液444-40.02mol/L琥珀酸溶液---4-0

4、.2mol/L丙二酸溶液--44-0.02mol/L丙二酸溶液-4--4蒸餾水4---240.02mol/L美藍(lán)溶液22222將上述各試管液混勻后，沿各管壁加入液體石蠟5～10滴，使其在液面形成一薄層以隔絕空氣。置于37℃水浴中保溫，記錄各管保溫開始時(shí)間及美藍(lán)開始脫色的時(shí)間。3．計(jì)算并解釋各管美藍(lán)顏色變化原因。美藍(lán)開始脫色時(shí)間－保溫開始時(shí)間＝美藍(lán)脫色所用時(shí)間?！咀⒁馐马?xiàng)】1．加液體石蠟時(shí)宜斜執(zhí)試管，沿管內(nèi)壁緩緩加入，不要產(chǎn)生氣泡。2．加完液體石蠟后，觀察結(jié)果過程中，不要振搖試管，以免溶液與空氣接觸而使美白重新氧化變藍(lán)。

5、3．實(shí)驗(yàn)完畢，一定要將試管內(nèi)的液體石蠟洗凈?！舅伎碱}】1．試根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，說明競爭性抑制作用的特點(diǎn)。2．本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則是什么？3．做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有哪些？