海南與越南緬甸蟒線粒體控制區(qū)遺傳多樣性及差異性分析

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1、海南與越南緬甸蟒線粒體控制區(qū)遺傳多樣性及差異性分析摘要：為了更有效地保護(hù)、管理和繁育緬甸蟒（Pythonbivittatus）瀕危物種，有必要利用分子技術(shù)對(duì)地方物種多樣性和遺傳分化進(jìn)行研究。試驗(yàn)采用TA克隆雙向測(cè)序方法對(duì)來(lái)自海南的37條緬甸蟒和來(lái)自越南的28條緬甸蟒部分控制區(qū)II序列進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，兩個(gè)地理群體共分為25個(gè)單倍型，單倍型多樣度（Hd）為0.877±0.025,核苷酸多樣性（Ji）為0.00476±0.00041，平均核苷酸差異數(shù)（k）為2.676，顯示緬甸蟒整體遺傳多樣性不高；通過(guò)比較

2、兩群體遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)海南緬甸蟒的單倍型多樣度要高于越南緬甸蟒，但核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)低于越南緬甸蟒;基于控制區(qū)構(gòu)建ML樹(shù)和Network網(wǎng)絡(luò)分析顯示，兩群體均各自形成了明顯的兩大分支；通過(guò)海南計(jì)算得到兩群體的固定指數(shù)（Fst）為0.201（P島位于中國(guó)南部，與越南隔海相望。島嶼具有與陸地界限明確、受陸地物種影響小等獨(dú)有特點(diǎn)，因此是研究物種進(jìn)化、演替和新物種形成的絕好地理環(huán)境。海南島蟒蛇具有這些特征。目前，關(guān)于越南緬甸蟒線粒體基因組全序列和來(lái)自海南緬甸蟒線粒體基因組全序列已經(jīng)公布［6］，通過(guò)比對(duì)發(fā)

3、現(xiàn)其在控制區(qū)II位置變異最大。此外，人們?cè)陲曫B(yǎng)過(guò)程中，發(fā)海南與越南緬甸蟒線粒體控制區(qū)遺傳多樣性及差異性分析摘要：為了更有效地保護(hù)、管理和繁育緬甸蟒（Pythonbivittatus）瀕危物種，有必要利用分子技術(shù)對(duì)地方物種多樣性和遺傳分化進(jìn)行研究。試驗(yàn)采用TA克隆雙向測(cè)序方法對(duì)來(lái)自海南的37條緬甸蟒和來(lái)自越南的28條緬甸蟒部分控制區(qū)II序列進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，兩個(gè)地理群體共分為25個(gè)單倍型，單倍型多樣度（Hd）為0.877±0.025,核苷酸多樣性（Ji）為0.00476±0.00041，平均核苷酸差異數(shù)（

4、k）為2.676，顯示緬甸蟒整體遺傳多樣性不高；通過(guò)比較兩群體遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)海南緬甸蟒的單倍型多樣度要高于越南緬甸蟒，但核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)低于越南緬甸蟒;基于控制區(qū)構(gòu)建ML樹(shù)和Network網(wǎng)絡(luò)分析顯示，兩群體均各自形成了明顯的兩大分支；通過(guò)海南計(jì)算得到兩群體的固定指數(shù)（Fst）為0.201（P島位于中國(guó)南部，與越南隔海相望。島嶼具有與陸地界限明確、受陸地物種影響小等獨(dú)有特點(diǎn)，因此是研究物種進(jìn)化、演替和新物種形成的絕好地理環(huán)境。海南島蟒蛇具有這些特征。目前，關(guān)于越南緬甸蟒線粒體基因組全序列和來(lái)

5、自海南緬甸蟒線粒體基因組全序列已經(jīng)公布［6］，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其在控制區(qū)II位置變異最大。此外，人們?cè)陲曫B(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)同齡海南緬甸蟒與越南額甸蟒在個(gè)體大小和生長(zhǎng)速度上有顯著性差異，因此有必要利用分子技術(shù)探討這兩種緬甸蟒遺傳差異。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用線粒體上控制區(qū)、CYTB以及微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)緬甸蟒遺傳多樣性進(jìn)行了研究［7-9］，取得了一定的研究成果，對(duì)于地方種群的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、種群多樣性以及對(duì)入侵種群的管理有一定的參考價(jià)值，但目前關(guān)于海南緬甸蟒種群遺傳多樣性的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為了更有效地保護(hù)、管理和繁育緬甸蟒瀕危物種

6、，特別是海南緬甸蟒，有必要采用現(xiàn)代分子遺傳技術(shù)對(duì)種群進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化分析。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定中國(guó)海南島和越南的緬甸蟒控制區(qū)II3'端序列，研究?jī)傻胤椒N群緬甸蟒遺傳多樣性，探討海南與越南額甸蟒遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳差異，以期能為海南和越南銅甸蟒的正確區(qū)分提供重要的科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1樣本采集本試驗(yàn)從海南蟒蛇研究所的10000條蟒蛇中隨機(jī)抽取海南緬甸蟒37條、越南緬甸蟒28條，采用心臟采血法每條抽取1.5mL血液，檸檬酸鈉抗凝，立即提取總DNA（參照天根DP304離心柱型基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作），檢測(cè)

7、樣品濃度和純度，并稀釋至100ng/uL,-20°C分裝保存。1.2PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序PCR擴(kuò)增引物，上游引物序列為：5'-CTCCGAATAAATCCCAATC-3’；下游引物序列為：5'?CTTGTTGCCGCTTCTGTGG-3，。PCR擴(kuò)增體系為50uL：TaqMasterMix混合液25uL，總DNA模板100ng，最后補(bǔ)水至50uLoPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸1min,30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳

8、檢測(cè)，回收目的條帶。將目的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序。具體步驟：T4DNA連接酶作用下16°（2過(guò)夜一連接至PMD20-T載體一轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a—LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12挑取陽(yáng)性克隆菌落-*菌落PCR驗(yàn)證提取質(zhì)?！ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰続BI3730型全自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)序。1.3序列分析所得序列用DNASTAR7.10中的SeqManll進(jìn)行序列校對(duì)及拼接。用BioEdit7.0軟件進(jìn)行多重比對(duì)，DnaSP3.0