hplc法測定蛤蚧中膽甾醇含量

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1、HPLC法測定蛤蚧中膽甾醇含量【關(guān)鍵詞】蛤蚧；膽甾醇；高效液相色譜法；含量測定Keyination蛤蚧系名貴中藥,具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精之功效,多用于治療肺虛氣喘、咳血、陽痿遺精等。現(xiàn)代藥理研究表明,蛤蚧的脂溶性提取物有抗炎和性激素樣作用。膽甾醇是脂溶性提取物中的主要成分之一,因此,從蛤蚧中分離出膽甾醇并對其進行定量測定具有重要意義。膽甾醇的測定方法主要有吸光光度法、氣相色譜法與高效液相色譜法。吸光光度法成本低,操作簡單,但只能測定總甾體的含量,誤差較大,重現(xiàn)性較差[1]；氣相色譜法一般要將甾醇衍生化后再進行測定,前處理比較繁瑣[

2、2]；高效液相色譜法測定膽甾醇具有簡單、快速、重現(xiàn)性好的特點[3]。目前,關(guān)于蛤蚧膽甾醇的含量測定方法未見報道,本試驗擬建立高效液相色譜法對蛤蚧中的膽甾醇進行定量測定,為進一步探索蛤蚧的藥理作用提供理論依據(jù)。　　1材料高效液相色譜儀：LC-10ATVP色譜泵、SPD-10AVP可見紫外檢測器、SCL-10ATVP控制器、CLASS-VP5.02工作站、7725型手動進樣器(日本島津公司)。紫外分光光度計UV-2401PC(日本島津公司)。BF-2000A氮氣吹干儀(BFC八方世紀)。GL-88B旋渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司

3、)。蛤蚧藥材由本院中藥房提供,經(jīng)鑒定為脊索動物門爬行綱壁虎科動物蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus),藥材粉碎后過40目篩。膽甾醇標準品：Sigma公司(C8667)。甲醇為色譜純(Fisher公司)；石油醚、無水乙醇、正己烷、氫氧化鉀均為分析純(北京化工廠)?！　?方法與結(jié)果　　2.1色譜條件對膽甾醇標準溶液在200～400nm波長處進行掃描,在208nm處有最大吸收。色譜柱：HypersilODS2柱(4.6mm×150mm,5μm)；流動相：甲醇；檢測波長208nm；柱溫40℃；流速：1.0mL/min?！　?.2對照品溶液的

4、制備精密稱取膽甾醇對照品9.39mg,置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,即得0.939mg/mL的對照品溶液。　　2.3供試品溶液的制備取蛤蚧粗粉約0.5g,精密稱定,置索氏提取器中,以30mL石油醚(30～60℃)回流提取5h,回收石油醚并將浸膏揮至無醚味,精密稱定浸膏0.0291g,加入4mL0.5mol/L氫氧化鉀的乙醇溶液混勻,置80℃水浴中皂化20min,皂化過程中每5min渦旋30s,以保證脂肪完全皂化,皂化液冰水中冷卻,向其中加入0.8mL蒸餾水混勻,再加入4mL正己烷,離心2min(500r/min),取上層

5、有機相,用N2吹干,殘渣用甲醇0.5mL渦旋溶解,0.45μm有機膜過濾,收集濾液作為供試品溶液?！　?.4系統(tǒng)適應(yīng)性考察分別吸取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各15μL,按照“2.1”項下色譜條件進樣測定,色譜圖見圖1。樣品中膽甾醇得到較好分離,其色譜峰的保留時間和標準品一致?！　?.5線性關(guān)系的考察精密吸取膽甾醇對照品溶液50、100、200、400、800、1600μL,用甲醇稀釋成0.029、0.059、0.117、0.235、0.470、0.939mg/mL標準溶液,按上述色譜條件進行測定,每次進樣15μL,同一濃度重復(fù)進樣3次

6、,測得峰面積。以峰面積為縱坐標、膽甾醇濃度為橫坐標繪制標準曲線,通過回歸計算,得到回歸方程：Y＝2×10－7X－0.0217,r＝0.9995,線性范圍0.435～14.085μg?！　?.6精密度試驗取標準品溶液,濃度分別為0.029、0.235、0.939mg/mL,各進樣15μL,每種溶液在同一天測定6次,并連續(xù)測定3d,計算低、中、高3種濃度標準品溶液的日內(nèi)RSD分別為3.89%、4.11%、4.04%,日間RSD分別為3.59%、4.21%、4.15%?！　?.9回收率試驗　　精密稱取已知含量的蛤蚧藥粉(070708)6份,分別精

7、密加入一定量的膽甾醇對照品,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,測定膽甾醇的含量,計算回收率,結(jié)果見表1。表1回收率測定結(jié)果(略)　　2.10樣品測定　　取蛤蚧藥粉5批,按“2.3”項下供試品溶液制備方法,按上述色譜條件進行含量測定,用外標法計算。5批樣品的膽甾醇含量見表2。表2樣品中膽甾醇含量測定結(jié)果（略）　　3討論蛤蚧樣品采用石油醚作提取溶劑,索氏提取器回流提取,并用紫外掃描的方法監(jiān)測提取終點,大約5h時提取液在紫外208nm處無吸收,因此,確立樣品回流提取時間為5h,試驗表明,該法提取完全,回收率好?！　≡趯Ω蝌恢苄蕴崛∥镞M行皂化時

8、借鑒了微型皂化方法[4],分別考察了2、3、4、5mL的0.5mol/L氫氧化鉀的乙醇皂化效果,確定4mL為皂化最佳劑量?！　∥墨I報道中有用電化學(xué)檢測器[5]、蒸發(fā)光散射檢測器[