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1、HPLC法測定蛤蚧中膽甾醇含量論文.freelm×150mm,5μm)；流動相：甲醇；檢測波長208nm；柱溫40℃；流速為1.0mL/min。結(jié)果膽甾醇質(zhì)量在0.885～14.000μg范圍與峰面積值的線性關(guān)系良好(r＝0.9995),平均回收率99.65%,RSD＝3.45%(n＝6)。結(jié)論本方法簡便可行、快速準確,可用于蛤蚧中膽甾醇的含量測定?！娟P(guān)鍵詞】蛤蚧；膽甾醇；高效液相色譜法；含量測定Keyination蛤蚧系名貴中藥,具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精之功效,多用于治療肺虛氣喘、咳血、陽痿遺精等?，F(xiàn)代藥理研究表明,蛤蚧的脂溶性提取物有抗炎和性激素樣作用。膽甾醇是
2、脂溶性提取物中的主要成分之一,因此,從蛤蚧中分離出膽甾醇并對其進行定量測定具有重要意義。膽甾醇的測定方法主要有吸光光度法、氣相色譜法與高效液相色譜法。吸光光度法成本低,操作簡單,但只能測定總甾體的含量,.freela公司(C8667)。甲醇為色譜純(Fisher公司)；石油醚、無水乙醇、正己烷、氫氧化鉀均為分析純(北京化工廠)。2方法與結(jié)果2.1色譜條件對膽甾醇標準溶液在200～400nm波長處進行掃描,在208nm處有最大吸收。色譜柱：HypersilODS2柱(4.6mm×150mm,5μm)；流動相：甲醇；檢測波長208nm；柱溫40℃；流速：1.0mL/min。2.
3、2對照品溶液的制備精密稱取膽甾醇對照品9.39mg,置于10mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,即得0.939mg/mL的對照品溶液。2.3供試品溶液的制備取蛤蚧粗粉約0.5g,精密稱定,置索氏提取器中,以30mL石油醚(30～60℃)回流提取5h,回收石油醚并將浸膏揮至無醚味,精密稱定浸膏0.0291g,加入4mL0.5mol/L氫氧化鉀的乙醇溶液混勻,置80℃水浴中皂化20min,皂化過程中每5min渦旋30s,以保證脂肪完全皂化,皂化液冰水中冷卻,向其中加入0.8mL蒸餾水混勻,再加入4mL正己烷,離心2min(500r/min),取上層有機相,用N2吹干,殘渣
4、用甲醇0.5mL渦旋溶解,0.45μm有機膜過濾,收集濾液作為供試品溶液。2.4系統(tǒng)適應性考察分別吸取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各15μL,按照“2.1”項下色譜條件進樣測定,色譜圖見圖1。樣品中膽甾醇得到較好分離,其色譜峰的保留時間和標準品一致。2.5線性關(guān)系的考察精密吸取膽甾醇對照品溶液50、100、200、400、800、1600μL,用甲醇稀釋成0.029、0.059、0.117、0.235、0.470、0.939mg/mL標準溶液,按上述色譜條件進行測定,每次進樣15μL,同一濃度重復進樣3次,測得峰面積。以峰面積為縱坐標、膽甾醇濃度為橫坐標繪制標準曲線,通
5、過回歸計算,得到回歸方程：Y＝2×10－7X－0.0217,r＝0.9995,線性范圍0.435～14.085μg。2.6精密度試驗取標準品溶液,濃度分別為0.029、0.235、0.939mg/mL,各進樣15μL,每種溶液在同一天測定6次,并連續(xù)測定3d,計算低、中、高3種濃度標準品溶液的日內(nèi)RSD分別為3.89%、4.11%、4.04%,日間RSD分別為3.59%、4.21%、4.15%。2.7穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液,分別于2、4、6、8、10、12h進樣分析,記錄膽甾醇峰面積,結(jié)果RSD＝3.65%,表明樣品溶液在12h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。2.8重復性試驗取同一批蛤蚧
6、藥粉共6份,每份0.5g,精密稱量,按照“2.3”項下方法制備供試品溶液,進樣測定膽甾醇峰面積,結(jié)果RSD＝2.75%,表明該條件重復性好。2.9回收率試驗精密稱取已知含量的蛤蚧藥粉(070708)6份,分別精密加入一定量的膽甾醇對照品,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,測定膽甾醇的含量,計算回收率,結(jié)果見表1。表1回收率測定結(jié)果(略)2.10樣品測定取蛤蚧藥粉5批,按“2.3”項下供試品溶液制備方法,按上述色譜條件進行含量測定,用外標法計算。5批樣品的膽甾醇含量見表2。表2樣品中膽甾醇含量測定結(jié)果（略）3討論蛤蚧樣品采用石油醚作提取溶劑,索氏提取器回流提取,并用紫外掃描
7、的方法監(jiān)測提取終點,大約5h時提取液在紫外208nm處無吸收,因此,確立樣品回流提取時間為5h,試驗表明,該法提取完全,回收率好。在對蛤蚧脂溶性提取物進行皂化時借鑒了微型皂化方法4,分別考察了2、3、4、5mL的0.5mol/L氫氧化鉀的乙醇皂化效果,確定4mL為皂化最佳劑量。文獻報道中有用電化學檢測器5、蒸發(fā)光散射檢測器6的高效液相色譜法測定膽甾醇含量。本試驗采用紫外檢測器的高效液相色譜法,選用HypersilODS2色譜柱(4.6mm×150mm,5μm),以甲醇作流動相就可以達到良好的分離效果,而且峰形對稱,
