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《pcr法測(cè)量硅藻ssu基因于溺死鑒定的運(yùn)用研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、PCR法測(cè)量硅藻SSU基因于溺死鑒定的運(yùn)用研究-->第一章引言水或其他液體堵塞呼吸道，出現(xiàn)呼吸障礙而發(fā)生機(jī)械性死亡稱為溺死.據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界有14萬(wàn)人溺死[2]。我國(guó)沿海、沿江地區(qū)溺死的案件也很多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，溺死尸體約占法醫(yī)尸體檢驗(yàn)的20%。珠江三角洲地區(qū)河道水網(wǎng)密集，每年發(fā)現(xiàn)的水中尸體達(dá)1000多具。溺死是由于大量液體進(jìn)入呼吸道所引起的窒息死亡。在江河湖海中發(fā)現(xiàn)的尸體絕大多數(shù)屬于意外溺水死亡，但也部分為自殺或他殺，還有部分是死后拋尸入水偽造意外溺水身亡，因此水中尸體可能與刑事案件相關(guān)，必須進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定。確定生前入水和死后入水是解決此類案件的關(guān)鍵。據(jù)調(diào)查，每年全世界因溺死導(dǎo)致死亡的人
2、數(shù)達(dá)到3.5/10萬(wàn)，對(duì)于未成年人，溺死排在意外死亡原因的第二位，因此對(duì)水中尸體死因的正確鑒定直接關(guān)系到尸體檢驗(yàn)的質(zhì)量和案件的定性。對(duì)于新鮮的水中尸體，可通過(guò)體表改變、內(nèi)部器官征象、組織病理學(xué)檢驗(yàn)以及左右心腔內(nèi)血液成份的不同等進(jìn)行溺死鑒定。但是，法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中遇到的水中尸體大部分已腐敗或髙度腐敗，甚至已經(jīng)白骨化，這類尸體的各種溺死征象已不存在，死因診斷是國(guó)際法醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的難題。此時(shí)往往需要通過(guò)一些輔助檢測(cè)方法來(lái)診斷溺死，其中相對(duì)成熟的方法是桂藻檢驗(yàn)法（主要包括光鏡下、電鏡下形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)數(shù))。硅藻細(xì)胞壁含無(wú)結(jié)晶的不易被破壞的含水桂酸鹽（Si02.H20),能對(duì)外界環(huán)境變化有較強(qiáng)的抵抗力，
3、有實(shí)驗(yàn)表明進(jìn)入肺臟內(nèi)的硅藻較少受到腐敗等因素的影響，因此桂藻檢測(cè)成為診斷溺死的重要輔助手段之一。.......第二章PCR-Agarose電泳檢測(cè)桂藻SSU基因方法建立2.1材料于冬季，在南沙虎門大橋處，將生前溺死組實(shí)驗(yàn)兔置籠中，沉入海水下0.5m5s后提出水面10s,再重新沉入相同海水深處，重復(fù)上述步驟直致實(shí)驗(yàn)兔溺死，死后在水下0.5m處浸泡24h;死后入水組采用空氣栓塞法處死后’置于相同海水深度浸泡24h后取出；對(duì)照組釆用空氣栓塞法處死后不做任何處理。提取各組兔子肺、肝、腎邊緣部位組織置于一40°C冰箱保存。提取一份溺死地點(diǎn)水樣l00Ml。2.2方法對(duì)60只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織臟器用重蒸
4、水反復(fù)沖洗，去除組織外的包膜，分別在不同組織的邊緣部位取材，用潔凈的眼科剪將組織剪碎至勻裝，取適量上述組織分別置入不同的潔凈15mleppendorf管中，在eppendorf管中加入O.Olmol/LTris-Hcl緩沖液10ml后，分別加胰蛋白酶于不同管中使其濃度為20mg/ml，置5(rC恒溫箱內(nèi)6h后觀察，待液體近透明時(shí)，12OOOrpm離心30min后，緩慢取出離心管，用潔凈的吸管吸去上層上清液（極力避免震蕩），底層含有硅藻，用于下游實(shí)驗(yàn)。將冰箱內(nèi)的桂藻水樣及用于陰性對(duì)照的非桂藻水樣取出，解凍后上次混勾數(shù)次，用潔凈的吸管吸取2ml水樣置于潔凈的離心管中，12OOOrpm離心3
5、0min后，緩慢取出離心管，用潔凈的吸管吸去上層上清液（極力避免震蕩)，底層含有桂藻，用于下游實(shí)驗(yàn)。制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml,)：稱取0.7g(0.5g)瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70ml,(50inl)lxTAE,瓶口倒扣小燒杯或用錫紙將錐形瓶瓶口封住，微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，核酸染色劑。膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位I并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勾小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展幵，直到整個(gè)玻璃板表面
6、形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加IxTAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板l-2mm為止。第三章PCR-CE法檢測(cè)硅藻SSU基因......183.1材料............19第四章PCR-DHPLC法檢測(cè)硅藻SSU基因...........294.1材料........314.2方法.........32全文小結(jié)........40第四章PCR-DHPLC法檢測(cè)桂藻SSU基因4.1材料20只溺死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、腎、肺組織已在上述實(shí)驗(yàn)中提取并保存于-4(rc冰箱；10例溺死診斷陽(yáng)性的人體器官組織檢材由廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所提供；
7、對(duì)照樣本：廣州珠江段5種最常見(jiàn)桂藻樣本(小環(huán)藻，直鏈藻，菱形藻，針桿藻,舟形藻）由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物溺死地點(diǎn)水樣100ml己在上述實(shí)驗(yàn)中提取并保存。4.2方法對(duì)10例溺死診斷陽(yáng)性的人體組織器官和溺死動(dòng)物的組織器官用重蒸水反復(fù)沖洗，去除組織外的包膜，分別在不同組織的邊緣部位取材，用潔凈的眼科剪將組織剪碎至勾衆(zhòng)，取適量組織置于不同的潔凈15inleppendorf管中，在eppendorf管中加入Tris-Hc緩沖液10ml后，
