pcr法檢測硅藻ssu基因在溺死鑒定中的應用

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1、中文摘要南方醫(yī)科大學2011級碩士學位論文PCR法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應用Theforensicapplicationstudyonthedetectionofdia幻mSSUgenebasedinPCRmethod課題來源：公安部重點研究計劃項目(2010zDYJGDST017)學位申請人余政梁導師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學院劉超法醫(yī)學學術型全日制碩士研究生學院2014年4月22日廣州碩士學位論丈刪lllI

2、㈣㈣㈣㈣呲Y2618343PCR法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應用碩士研究生：余政梁導師：劉超主任法

3、醫(yī)師撬要目的：溺死(drowning)是機械性死亡的一種。我國河道水網(wǎng)密集，水中尸體多發(fā)，在江河湖海中發(fā)現(xiàn)的尸體可能屬于意外溺水死亡，但也可能為自殺或他殺，也不排除死后拋尸入水偽造意外溺水身亡，因此水中尸體可能與刑事案件相關，必須進行法醫(yī)學鑒定。溺死的鑒定及對其實用性、科學性的評價是法醫(yī)學領域長期以來的重要課題之一。確定生前入水和死后入水是解決溺死類案件的關鍵，由于其他生物學和尸體化學的溺死檢驗指標尚未得到科學的確認，因此，硅藻檢驗仍是目前鑒定溺死的“金標準”。近年來，對溺死的相關報道主要集中于不同水域溺死案件的鑒定或回顧性研究，且

4、主要著重于尸體臟器中硅藻的檢出及檢出率比較，對傳統(tǒng)硅藻提取、檢測方法的改良及優(yōu)缺點比較，而忽略臟器內(nèi)硅藻種類與溺死地點硅藻種類的比較及新的、靈敏度高、特異性強的硅藻檢驗方法的探索。本研究主要通過酶消化法分離硅藻，在保證操作者安全的同時，減少硅藻的破壞和損失；硅藻DNA的提取使用MoBio強力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoiITMDNAIsolationKit)，能高效提取硅藻基因組DNA，且DNA純度高，可直接用于下游實驗；選用硅藻特異性引物，通過PCR法擴增硅藻SSU基因，通過瓊脂糖凝膠電泳及PCR產(chǎn)物測序，驗證引物特異性。

5、DHPLC法不僅可以對PCR產(chǎn)物的片段大小進行分析，還能對PCR產(chǎn)物的構象及堿基組成比例進行檢測分析，因此本研究采用DHPLC法(高效變性液相色譜法)對溺死人體臟器及溺死地點水樣中的硅藻進行分析，區(qū)分不同水域硅藻種屬，為判斷溺死人體臟器內(nèi)硅藻種屬與溺死地點硅藻種屬是否相同提供依據(jù)，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。此外，本研究中還應用了毛細管電泳檢測硅藻ssU基因，此法也具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，毛細管電泳法因其應用廣泛、操中文摘要作簡單，因此在溺死鑒定和溺死地點推斷中易普及推廣，為硅藻檢驗提供了～種新方法、新思路。方法：把實驗動物

6、60只隨機分成3組，分別為生前溺死(水中溺斃)、死后入水(空氣栓塞致死后入水)、對照組(空氣栓塞致死后不做處理)，每組20只：從廣州市刑事科學技術研究所獲取溺死診斷陽性人體臟器組織30份，包括肺、肝、腎組織，提取各組織檢材硅藻DNA，PCR擴增硅藻特異的核糖體小亞基(SSU)片段，用瓊脂糖凝膠電泳檢測、PCR．D瑚)LC檢測、PCR-CE檢測分析，評估PCR．DHPLC法和PCR．CE檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應用價值。結(jié)果：在動物實驗中，生前溺死組肺、肝、腎硅藻檢出率分別為100％、90％、85％，死后入水組僅肺檢出硅藻(1

7、5％)，對照組各組織均為陰性：生前溺死組檢出率明顯高于死后入水組(P<0．05)。通過PCR．CE法對20只溺死實驗動物的肝、腎、肺進行檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著檢材量的增加，檢出的硅藻種類數(shù)增加，且均存在正相關；肺內(nèi)檢出硅藻種類與檢材量的相關系數(shù)是0．433(P<0．01)，肝內(nèi)檢出硅藻種類與檢材量的相關系數(shù)是0．623(P

8、時，腎內(nèi)檢出硅藻種類以1種及1種以上為主。20例溺死診斷陽性的人體器官組織檢材用PCR．CE法檢出硅藻種類明顯多于微波消解．掃描電鏡法(P

9、。通過碩士學位論文PCR-CE法檢測硅藻SSU基因，具有很強的靈敏度和特異性，且具有較好的普及性和推廣性，為法醫(yī)學硅藻檢驗提供了一條新思路?！娟P鍵詞】法醫(yī)病理學；溺死：硅藻檢驗；SSU；PCR；DHPLC；CE．碩士學位論文Thefo