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1、OPA在線柱前衍生化HPLC【摘要】目的建立一種新的在線柱前衍生化HPLC-FLD法測定血漿中的阿米卡星。方法血漿樣品堿化后用乙腈沉淀蛋白，上清液用OPA程序在線衍生化后進樣分析。色譜柱：AgilentXDB-C18(5μm，4.6mm×150mm);流動相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鈉(70∶30，pH=3.67);熒光檢測：λex=342nm，λem=440nm;流速：1.0mL/min;柱溫：40℃;樣品盤溫度10℃;進樣量：10μL;衍生化時間：1min。結(jié)果該法測定血漿中阿米卡星定量下限為1mg/L,線性范圍在1～50m
2、g/L(r=0.9993);日內(nèi)、日間RSD小于11%，絕對回收率大于90%，相對回收率大于95%。結(jié)論本法準確、靈敏、易于操作，可用于阿米卡星的血藥濃度測定及藥動學研究?！娟P鍵詞】硫酸阿米卡星;在線柱前衍生化;高效液相熒光檢測法;血漿藥物濃度硫酸阿米卡星(Amikacin)為半合成氨基糖苷類抗生素,對大多數(shù)氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定，適合于治療革蘭陰性桿菌中卡那霉素、慶大霉素或妥布霉素耐藥菌株所致感染。對多數(shù)腸桿菌科細菌具有良好作用,對銅綠假單胞菌具有高效，而且與其它抗生素無交叉耐藥性，抗菌作用比卡那霉素強。但是阿米卡星有腎毒性、聽覺器官毒
3、性和神經(jīng)肌肉阻滯等毒副作用，在臨床使用時，最好根據(jù)其體內(nèi)血藥濃度數(shù)據(jù)個體化給藥，因此建立檢測阿米卡星血藥濃度的方法十分必要。由于阿米卡星化學結(jié)構(gòu)沒有強紫外吸收基團,并且血漿中阿米卡星濃度極低,紫外檢測器難以檢測。本實驗參考有關文獻[1-5]，建立在線柱前衍生化HPLC熒光檢測方法，以測定人血漿中阿米卡星的濃度?！ ?材料 美國Agilent1200型高效液相色譜儀(自動進樣器，四元梯度泵，可控柱溫箱，熒光檢測器，Chemistations化學工作站)，pHS-3B型精密pH計(上海雷磁儀器廠),TGL-20M臺式高速冷凍離心機(湖南賽
4、特湘儀),梅特勒十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler公司),XH-B漩渦混合器(姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司)?！ “⒚卓ㄐ菍φ掌?中國藥品生物制品檢定所，批號：130335-200204);鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde，OPA),Sigma公司生產(chǎn)，批號：2114022;甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純;水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);空白血漿(購于本院輸血科)。 2方法與結(jié)果 2.1色譜條件色譜柱：AgilentZorbaxEcliPseXDB-C18(5μm，4.6mm×150mm);保護柱:
5、AgilentZorbaxSB-C18(5μm，12.5mm×4.6mm);流動相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鈉(pH=3.67)，70∶30;熒光檢測：激發(fā)波長342nm，發(fā)射波長440nm;流速：1.0mL/min;柱溫：40℃;樣品盤溫度10℃;進樣量：10μL;衍生化時間：1min。 2.2柱前程序衍生自動進樣器樣品盤編號：1為OPA衍生化試劑，2為色譜純乙腈(未加蓋)，3為純水(未加蓋);進樣順序：從樣品盤中吸取經(jīng)堿化乙腈沉淀蛋白后20μL血漿樣品，從2中吸取0.0μL乙腈，從1中吸取20μLOPA硼酸鹽溶液，從3中吸
6、取0.0μL純水，空氣中最大混合速度混合5次，等待1min后進樣。 2.3對照品溶液和衍生化試劑的配制精密稱取阿米卡星對照品10.0mg，至10mL棕色容量瓶中，用純化水溶解并定容至刻度，置冰箱4℃貯存?zhèn)溆谩＞芊Q取OPA400mg溶于8mL甲醇中，再加8mLα-巰基乙醇，用pH=10.4、0.4mol/L的硼酸緩沖液定容至100mL棕色容量瓶，臨用前用0.22μm濾膜過濾，取濾液置自動進樣器供衍生化?！ ?.4血漿樣品衍生化前處理精密量取血漿樣品200μL于離心試管中，加入pH=10.38硼酸緩沖液200μL，漩渦混合后，加入乙腈4
7、00μL，旋渦振蕩1min，12000r/min離心10min，吸取上清液200μL置自動進樣器衍生化。 2.5標準曲線的繪制配制阿米卡星血漿濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg/L，按“2.4項”下進行，然后置自動進樣器按“2.3項”下所述方法操作，進行色譜分析，以濃度為橫坐標，衍生化產(chǎn)物的峰面積為縱坐標做回歸曲線，得方程：Y=89.489X-16.804，(r=0.9993,n=6)，在1.0～50mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，定量下限為1.0mg/L?！ ?.6回收率與精密度試驗分別配制濃度為2.
8、0、10.0、50.0mg/L阿米卡星血漿樣品，按“2.4項”下處理，然后置自動進樣器按“2.4項”下所述方法操作，按回歸方程計算實測濃度，分別在同一天內(nèi)測定5次，連續(xù)3d，結(jié)果見表1。表1阿米卡星衍生產(chǎn)物
