opa-fmoc柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培

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1、OPA/FMOC柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培【摘要】目的：該實(shí)驗(yàn)建立了以O(shè)PA/FMOC作為柱前衍生化試劑，采用高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸含量的方法。在10～180μg.mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)在0.9953～1.000之間,平均回收率95.9%～102.4%,CV%<3.8%(n=5),重復(fù)性RSD為0.08%～3.82%(n=6)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便快速，適用于細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸的含量測(cè)定?！娟P(guān)鍵詞】OPA/FMOC柱前衍生法；細(xì)胞培養(yǎng)基M199；氨基酸；高效液相色譜細(xì)胞培養(yǎng)基作為細(xì)胞工程重要的原材料，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到生物

2、制品的產(chǎn)量，是生物制品企業(yè)非常重視的基礎(chǔ)原料。而所有的細(xì)胞培養(yǎng)基均含有氨基酸、維生素等必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們是維持和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的主要因素。這些物質(zhì)含量的多少是衡量細(xì)胞培養(yǎng)基能否促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要指標(biāo),也是檢定培養(yǎng)基是否符合工藝規(guī)定的質(zhì)量指標(biāo)。因此，確立如何測(cè)定培養(yǎng)基中氨基酸的含量是細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)廠商保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵工作。氨基酸的分析方法在近幾年已得到了很大的改進(jìn)和完善，衍生化測(cè)定是氨基酸兩類分析方法之一[2]。對(duì)于各種保健品及復(fù)合氨基酸制劑，目前較多的采用PICT柱前衍生試劑測(cè)定氨基酸[5][6]。PICT不僅毒性大，且需要專門的衍生裝置在無水條件下進(jìn)行。AQC(6

3、-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯)柱前衍生測(cè)定氨基酸可以獲得較好的結(jié)果[4]，但分析時(shí)間較長(zhǎng)，衍生試劑昂貴且不易購得。OPA和FMOC（鄰苯二甲醛一氯甲酸芴甲酯）聯(lián)用作為衍化試劑具有衍生反應(yīng)迅速、分析周期檢短、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)，且衍生化過程完全自動(dòng)化操作，使分析效率大為提高。我們使用HypersilC18分析柱，可變波長(zhǎng)UV檢測(cè)器，OPA-FMOC柱前衍生測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基M199中氨基酸含量，自動(dòng)衍生進(jìn)樣后經(jīng)梯度洗脫可以在20min內(nèi)使20種氨基酸完全分離。分離效果，重現(xiàn)性，線性范圍均令人滿意。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器和試劑HP公司1050型高效液相色譜儀、四元梯度

4、泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、PhoenixDos化學(xué)工作站；分析天平BS210S，賽多利斯；pHS-3C數(shù)顯pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；乙酸鈉、四氫呋喃和三乙胺為分析純；乙腈和甲醇為色譜純；OPA10mg/ml，F(xiàn)MOC2.5mg/ml為HP公司產(chǎn)品；氨基酸對(duì)照品為sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)基M199為無錫市美迪生物制品有限公司產(chǎn)品。1.2色譜條件色譜柱：HypersilODS柱，5μm，125×4mmid；流動(dòng)相：A相：取20mM乙酸鈉+0.6%四氫呋喃+0.02%三乙胺，用稀醋酸調(diào)節(jié)PH至7.2。B相：100mM乙酸鈉（PH7.2）∶乙腈∶甲醇=100∶175∶2

5、25；流速：1.0ml/min；洗脫梯度：0.0-17.0minA相（%）100→40、B相（%）0→60，17.0-18.0minA相（%）40→0、B相（%）60→100；柱溫：40℃；波長(zhǎng)切換：0-14.5min、338nm，14.5-20min、262nm；衍生化及進(jìn)樣：5.0μl硼酸鹽緩沖液+1.0μlOPA液+1.0μl氨基酸液+1.0μlFMOC液按一定程序自動(dòng)混勻反應(yīng)后進(jìn)樣。1.3對(duì)照品及樣品制備對(duì)照品儲(chǔ)備液：按M199配方，分別稱取各種氨基酸適量，精密稱定，用水溶解并稀釋至50ml作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。供試品溶液：雖然M199中含有61種成分，但其中可溶性無機(jī)

6、鹽、葡萄糖、氨基酸占成分的98%以上，且各種難溶成分均通過不同工藝轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄晕镔|(zhì)，一些物質(zhì)又極微量，所以按配制說明制成溶液后，溶液澄清，pH為7.2，可以上機(jī)直接測(cè)定。2結(jié)果與討論2.1線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及分離圖譜分別精密量取各種氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、4、5ml，用水稀釋至100ml。按上述色譜條件測(cè)定各種氨基酸的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，20種氨基酸在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密量取各種氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液2ml，置一100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，20種氨基酸的色譜分離結(jié)果。2.2回收率測(cè)定按細(xì)胞培養(yǎng)基M199配方配制試樣，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次

7、，計(jì)算各氨基酸的回收率，20種氨基酸的平均回收率范圍是95.9～102.4%，RSD<3.8%(n=5)。2.3重現(xiàn)性試驗(yàn)取2.1項(xiàng)下用于色譜分離的對(duì)照品溶液，按上述操作程序連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)方法的重現(xiàn)性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，20種氨基酸的RSD為0.08%～3.82%(n=6)。2.4樣品氨基酸含量測(cè)定精密稱取細(xì)胞培養(yǎng)基M199約10g，按說明書要求配制成溶液，即為供試品溶液。根據(jù)上述色譜條件進(jìn)行分離分析，經(jīng)系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)各氨基酸之間的分離度應(yīng)大于1.0，以天門冬氨酸計(jì)算，理論塔板數(shù)應(yīng)大于3000，采用外標(biāo)法，