氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的應(yīng)用-論文.pdf

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1、口腔護理用品工業(yè)第二十四卷第四冊O(shè)RALCAREINDUSTRY2014年8月氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的應(yīng)用康春生于灝汪發(fā)文王辰旭田彩天(國家移動實驗室研究發(fā)展與評價中心哈爾濱150036)摘要：氨基酸分析已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，在食品領(lǐng)域尤顯突出。利用高效液相色譜分析氨基酸因其高效、簡便、快速、準(zhǔn)確和價格低廉等優(yōu)點，已得到快速發(fā)展，成為當(dāng)今氨基酸分析的重要手段之一。介紹了以熒光胺、氯甲酸芴甲酯、鄰苯二甲醛、2，4一二硝基氟苯、丹磺酰氯、異硫氰酸苯酯、6一氨基喹琳基一N一羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯等作為衍生劑的柱前衍生與HPLC分析方法的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：氨

2、基酸衍生化色譜分離測到或者區(qū)別開來。就進行衍生的先后來說，可以1前言分為柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生是指樣品先進由于氨基酸對人類生活的重要性，氨基酸分析行色譜分離，然后進行衍生化，再進行檢測。柱后衍一直是分析領(lǐng)域研究的重要課題之一。目前，氨基生技術(shù)與柱前衍生技術(shù)相比有以下優(yōu)點：反應(yīng)重復(fù)酸的分析方法很多，主要有高效液相色譜法，毛細管性好；未被衍生的化合物若有吸收時，也可同時進行電泳法，質(zhì)譜法(包括氣一質(zhì)譜法和液一質(zhì)譜法)分離和檢測。柱后衍生法僅需重現(xiàn)，可以使用一系等。氨基酸分析儀法是高效液相色譜法中最重要的列不同原理的檢測器，但它要求反應(yīng)室死體積要小，氨基酸分析方法，它操

3、作簡便，無需進行柱前衍生，反應(yīng)速率要快，過量試劑或試劑的水解產(chǎn)物可能造但是設(shè)備要求專用，因此成本較高，應(yīng)用范圍較窄。成干擾，通常需要特定的設(shè)備配件。由于以上的缺相較于其它方法而言，常規(guī)的高效液相色譜法點，柱前衍生越來越受到人們的重視。(HPLC)運用常規(guī)反應(yīng)裝置，具有高效、簡便、快速、3衍生化試劑準(zhǔn)確和價格低廉等優(yōu)點，已成為一種較為理想的檢測氨基酸的方法。氨基酸的衍生化試劑的種類繁多，理想的衍生根據(jù)分析時是否需要衍生，高效液相法分析氨試劑應(yīng)在很短的時間內(nèi)與氨基酸形成穩(wěn)定的、單一基酸可以分為直接分析法和衍生分析法。的且能反映原氨基酸結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，并且衍生反應(yīng)必須操作簡單、重

4、現(xiàn)性高，過量的衍生試劑應(yīng)該不干擾2氨基酸色譜分析方法以后的色譜分離和檢測，或者在必要的情況下很容2．1直接法易除去。常用的衍生化試劑有如下幾種。直接法采用離子交換色譜的氨基酸分析儀，對3．1熒光胺氨基酸進行直接分析，不需要衍生；采用高效陰離子熒光胺，F(xiàn)luorescamine(簡稱FA)，是苯乙醛在交換色譜積分脈沖安培檢測法進行檢測，不需要繁過量茚三酮的存在下迅速與氨基酸形成的強熒光產(chǎn)瑣的衍生步驟；操作簡單，靈敏度高，而且分離效果很物。熒光胺與氨基酸的反應(yīng)方程式如圖1所示。好。戴安公司上世紀(jì)推出的氨基酸AAA—Direct系統(tǒng)就是此種方法的代表，采用高效陰離子交換色譜積

5、分脈沖安培檢測法(HPAEC—IPAD)。但其價格昂一。一貴，分析時間長，專一性太強，投人大，局限性明顯，不利于普遍推廣。這些都限制了它的應(yīng)用和推廣。2．2衍生法圖1熒光胺與氨基酸的反應(yīng)方程式由于大部分氨基酸結(jié)構(gòu)簡單，而且彼此比較相該試劑具有一定選擇性，只與一級氨基酸反應(yīng)似，大多沒有發(fā)光或者發(fā)色基團，所以一般難以被檢生成熒光衍生物，二級氨基酸也與其反應(yīng)，但并不形2014年第4期康春生，等：氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的應(yīng)用49成熒光衍生物，對于檢測一級氨基酸是一種理想的氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、牛磺酸(Tau)、甘氨酸試劑，而且該反應(yīng)條件并不苛刻，反應(yīng)迅速，衍

6、生試(Gly)的含量，為目前缺血性腦損傷功能障礙機理劑本身對于反應(yīng)干擾小，其熒光激發(fā)波長390nm，發(fā)及健腦中藥的藥理研究提供了快速分析手段，為從射波長475nm。神經(jīng)生化角度揭示多發(fā)梗塞性癡呆的發(fā)生機制提供3．2氯甲酸芴甲酯了有意義的線索和依據(jù)。陳颯颯以鄰苯二甲醛9一fluorenylmethylchlorformate，簡稱FMOC—柱前衍生，ODSC18柱分離，PH6．0醋酸鹽緩沖溶液cl。和氨基酸反應(yīng)，既可以用作熒光檢測，同時也可與甲醇二元梯度洗脫，熒光檢測。結(jié)果僅在9min內(nèi)以用紫外檢測。熒光檢測的激發(fā)波長為265nm，發(fā)就分離測定了大鼠腦中5種氨基酸介質(zhì)的含

7、量。在射波長為310nm。該衍生反應(yīng)迅速，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，一定濃度范圍內(nèi)，氨基酸的峰面積與其濃度呈現(xiàn)良4℃下避光儲存13天不受影響。但該衍生試劑的選好的線性關(guān)系，得到方法適用于神經(jīng)藥理學(xué)的研究，擇性比較低，F(xiàn)MOC—C1的水解產(chǎn)物FMOC—OH均建立測定神經(jīng)中樞氨基酸類介質(zhì)的方法。有同F(xiàn)MOC一氨基酸類似的熒光干擾。魏京廣?等3．42，4一二硝基氟苯以鄰苯二甲醛(OPA)與氯甲酸芴甲酯(FMOC—C1)2，4一二硝基氟苯，2，4一dinitro—fluorobenzene，作衍生劑，正纈氨酸為內(nèi)標(biāo)，采用柱前衍生反相高效簡稱DNFB。DNFB