表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制人鼻咽癌細胞的生長機

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1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制人鼻咽癌細胞的生長機【摘要】目的：探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(-)epigallocatechin3gallate,EGCG］抑制人鼻咽癌E2Z細胞系生長增殖的機制,尋找鼻咽癌治療的新靶點.方法：用EGCG處理人鼻咽癌E2Z細胞,應用MTT試驗觀察不同濃度的EGCG對癌細胞生長增殖的影響；流式細胞儀檢測用藥前后細胞周期的變化；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應分析ras相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）mRNA表達情況.結(jié)果：從E2Z細胞生長曲線判定EGCG對細胞生長均有抑制作用；流式細胞分析結(jié)果顯示,G0/G1期細胞增加,S期細胞減少

2、；經(jīng)EGCG處理后,細胞中均有RASSF1AmRNA表達,且表達隨藥物濃度增高而增強.結(jié)論：EGCG對體外培養(yǎng)的鼻咽癌細胞生長增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的RASSF1A基因再轉(zhuǎn)錄,誘導該基因重新表達的結(jié)果.【關(guān)鍵詞】沒食子兒茶素沒食子酸酯RASSF1A基因E2Z細胞系甲基化　0引言　　鼻咽癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一,尤其在我國的南部地區(qū)有很高的發(fā)病率.鼻咽癌的治療方法主要是放射治療,目前的化療藥物療效均不十分顯著.表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(-)epigallocatechin3gallate,EGCG］能使因甲基化而失活的抑癌基因重

3、新表達，從而抑制腫瘤的生長［1］.我們用EGCG處理鼻咽癌E2Z細胞,觀察了其對E2Z細胞生長增殖的影響及ras相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)表達的變化,以尋找治療鼻咽癌的有效藥物.　　1材料和方法　　1.1材料人低分化鼻咽癌細胞系（E2Z）由廣東醫(yī)學院分子生物學與生物化學教研室惠贈.RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，碘化丙啶(PI)購于美國Sigma公司.EGCG購于美國Sigma公司.各PCR引物由上海生物工程公司合成.RTPCR試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品，流式細胞儀為EpicsX2型.　　1.2方法　　1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物

4、處理E2Z培養(yǎng)于含有100mL/L滅活的小牛血清、10萬U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37℃，50mL/LCO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，取對數(shù)生長期細胞實驗.按每孔3000個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，細胞接種16h后分別用不同濃度EGCG（0，50，100，200mg/L）處理，每5孔為一藥物濃度組，共接種4板，每日取1板，加入5g/LMTT液20μL,37℃孵育4h后棄去上清液,每孔加入DMSO150μL,震蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解,在570nm波長酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔A值,求其平均數(shù),繪制增值曲線.　　1.2.2

5、流式細胞術(shù)檢測細胞周期同樣方法接種處理E2Z細胞，48h后胰酶消化，收集細胞，700mL/L乙醇固定過夜，離心清洗后加入PI染液在流式細胞儀內(nèi)檢測各時相細胞比例.　　1.2.3半定量RTPCRTrizol法提取各組細胞的總RNA(操作步驟祥見說明書).以βactin為內(nèi)參照.βactin引物序列：上游引物5′GTGCGTGACATTAAGGAG3′，下游引物5′CTAAGTCATAGTCCGCCT3′，PCR產(chǎn)物大小517bp;RASSF1A引物序列:5′GCCCTCCAGCAAGAAG3′，5′TGAAGGCGTCCCAGTT3′,PCR

6、產(chǎn)物大小362bp.反應條件如下：50℃反轉(zhuǎn)錄30min,95℃15min,94℃變性1min,54℃退火45s,72℃延伸1min,進行30個循環(huán),72℃擴展10min.　　統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)用x±s表示.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，方差齊時各組間兩兩比較采用LDS檢驗進行，方差不齊時各組間兩兩比較采用TamhanesT2檢驗進行，P<0.05表示差異有顯著性意義.所有實驗至少重復3次.　　2結(jié)果　　2.1EGCG對細胞增值的影響經(jīng)0，50，100，200mg/L的EGCG分別處理后,E2Z細胞生長增殖曲線示:各種濃度的EGCG處理組與對照組(無藥

7、組)相比,腫瘤細胞增殖均被抑制,且濃度越高,抑制越明顯（圖1）.　　圖1不同濃度EGCG處理E2Z細胞的增殖曲線（略）　　2.2EGCG對E細胞周期的影響分別用不同濃度的EGCG（0，50，100，200mg/L）作用E2Z細胞48h，然后收集各組細胞以流式細胞儀檢測DNA的含量.結(jié)果表明：EGCG可以使其細胞周期G0/G1期比例增加（P<0.05），S期比例降低（P<0.05），說明EGCG作用E2Z細胞48h，可使其細胞周期阻滯于G0/G1期（表1）.　　表1EGCG作用48h后E2Z細胞周期分布（略）　　aP<0.05vs對照組.　

8、　2.3E