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《干擾rna抑制小鼠視網(wǎng)膜hif》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、干擾RNA抑制小鼠視網(wǎng)膜HIF.L.編輯。作者：熊宇 夏曉波 許惠卓 蔣劍 宋偉濤 劉雙珍 許雪亮【摘要】 目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）特異性小片段干擾性RNA（siRNA）對小鼠視網(wǎng)膜HIF-1α蛋白質(zhì)的抑制作用。方法：構(gòu)建HIF-1αsiRNA重組質(zhì)粒pSUPERsiHIF-1α。選擇7d齡C57BL/6J小鼠24只，其中6只為正常組（A）；另18只建立缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管模型，并隨機分為：對照組（B）、空載體組（C組）和基因治療組（D組），每組6只。于出艙前1d，向空載體組小鼠玻璃體腔注射pSUPER空載
2、體質(zhì)粒；基因治療組注射HIF-1αsiRNA重組質(zhì)粒pSUPERsiHIF-1α。采用FITC-Dextran熒光造影視網(wǎng)膜鋪片觀察4組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化；SP免疫組織化學(xué)檢測各組間HIF-1α的表達(dá)差異。結(jié)果：熒光造影視網(wǎng)膜鋪片顯示，A組整個視網(wǎng)膜血管分布呈均勻網(wǎng)狀；B、C組視網(wǎng)膜中周部可見大片無灌注區(qū)，見新生血管叢，伴熒光滲漏；D組無灌注區(qū)較B，C組明顯減少，周邊部毛細(xì)血管網(wǎng)基本正常，新生血管叢明顯減少。免疫組織化學(xué)染色顯示，A組HIF-1α蛋白表達(dá)陰性；B，C組在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層呈陽性表達(dá)；D組在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層呈弱陽性表達(dá)，較B
3、，C組明顯減少。結(jié)論：采用玻璃體腔注射，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)HIF-1αsiRNA重組質(zhì)粒pSUPERsiHIF-1α轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜，有效地抑制了缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型視網(wǎng)膜中HIF-1α蛋白質(zhì)的表達(dá)及視網(wǎng)膜新生血管的形成?！娟P(guān)鍵詞】小干擾RNA 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 視網(wǎng)膜新生血管 基因治療 InhibitoryeffectofinterferingRNAtargetingHIF-1αprotEininmiceretinaAbstractAIM:Toinvestigatetheinhibitoryeffectofinterferi
4、ngRNAtargetingHIF-1αprotEInintheretinaofmice.METHODS:HIF-1αsiRNAiceinthenormalgroup(A),andanother18micelyintocontrolgroup(B),vectorgroup(C)andgenetherapygroup(D),iceineachgroup,eidandHIF-1αsiRNAiceovedouttoroomairfromthecabin.FITC-Dextranangiographyongeachgroupmunohist
5、ochemistry.RESULTS:Retinalflat-mountsafterFITC-DextranangiographyindicatedthatthevesselsofnormalmiceformedafinedradialbranchingpatterningroupA.2000（LF2000）和Trizol均購自美國Invitrogen公司。FITC-Dextran購自美國sigma公司。山羊抗鼠HIF-1α抗體購自美國SantaCruz公司。根據(jù)人類基因庫中人HIF-1α基因（NM_001530）的mRNA序列設(shè)計
6、siRNA作用靶點，其靶序列為AAGAGGTGGATATGTCTGG（1214－1232）?；瘜W(xué)合成64nt的shHIF-1α（HIF-1α小發(fā)夾RNA）寡核苷酸序列并退火形成雙鏈模板。采用Hind和Bgl雙酶切pSUPER.retro空載體質(zhì)粒，然后與退火形成的雙鏈模板體外連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選等步驟后抽提HIF-1αsiRNA重組質(zhì)粒，并命名為pSUPERsiHIF-1α。并測序鑒定重組質(zhì)粒中shHIF-1α寡核苷酸插入序列的準(zhǔn)確性。1.2方法采用Smith等[3]的氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型。將18只出生7d后(P7)的C5
7、7BL/6J小鼠及其母鼠置于密閉的氧艙，溫度控制在（21±1）℃，艙內(nèi)通入100%濕潤的醫(yī)用氧氣，用CYS-I型數(shù)字測氧儀測量氧艙的氧氣體積分?jǐn)?shù)，每6h一次，控制氧氣體積分?jǐn)?shù)(750±20)mL/L，5d后(P12)回到正常氧環(huán)境，氧氣體積分?jǐn)?shù)為(200±10)mL/L，制作缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，并隨機分為對照組（B組）、空載體組（C組）和基因治療組（D組），每組6只。另取6只正常的P19C57BL/6J小鼠作為對照（A組）。在小鼠出艙的前1d，向空載體組（C組）小鼠玻璃體腔注射空載體質(zhì)粒（pSUPER.retro）-脂
8、質(zhì)體復(fù)合物共1μL；基因治療組（D組）小鼠注射HIF-1αsiRNA重組質(zhì)粒（pSUPERsiHIF-1α）-脂質(zhì)體復(fù)合物共1μL。注射完后立即放回氧艙，1d后小鼠重新出艙。對照組小鼠不作轉(zhuǎn)染。1.2.1視網(wǎng)膜FITC-dextran
