慢性鉛暴露對(duì)小鼠pcreb蛋白表達(dá)影響

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1、慢性鉛暴露對(duì)小鼠pCREB蛋白表達(dá)影響文濤，劉陽(yáng)，孫黎光，張力，趙曉光，高明奇，宗志宏，劉素媛【摘要】目的探討鉛對(duì)小鼠海馬磷酸化環(huán)磷酯腺苷(cAMP)反應(yīng)成分結(jié)合蛋白(pCREB)表達(dá)的影響。方法小鼠出生第1d起染鉛組母鼠開(kāi)始通過(guò)飲水飼以24，48，96mmol/L濃度醋酸鉛。幼鼠出生后，先通過(guò)哺乳接觸鉛，斷乳后則自行飲用與母鼠飲用濃度相同的含鉛水。分別在14，28，42，56d處死小鼠，用蛋白免疫印記法觀察各組小鼠海馬區(qū)pCREB蛋白表達(dá)狀況。結(jié)果慢性鉛暴露小鼠腦海馬pCREB蛋白的表達(dá)總體上

2、呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，24mmol/L鉛暴露使14d小鼠pCREB蛋白表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞005)；而48，96mmol/L鉛暴露組pCREB蛋白表達(dá)一直維持在較低的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜005)。結(jié)論鉛擾亂pCREB蛋白正常表達(dá)。【關(guān)鍵詞】鉛　　鉛是工業(yè)應(yīng)用最廣泛的重金屬之一，在自然界中廣泛存在，居住環(huán)境中的生活性鉛污染嚴(yán)重危害著人類的健康，尤其是兒童鉛中毒流行比率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成人，明顯影響兒童的智力發(fā)育。本研究旨在通過(guò)觀察慢性醋酸鉛染毒小鼠海馬磷酸化環(huán)磷酸腺苷(cAM

3、P)反應(yīng)成分結(jié)合蛋白(pCREB)表達(dá)的影響來(lái)探討慢性鉛中毒分子機(jī)制?！　?材料與方法　　11材料昆明系小白鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)，雌雄2∶1，體重28～34g。分析純醋酸鉛和硝酸纖維素膜(中國(guó)實(shí)驗(yàn)原平皓公司)。十二烷基硫酸鈉(SDS)(華美生物技術(shù)公司)。牛血清白蛋白(聯(lián)星生物工程公司)。pCREB-抗(美國(guó)CellSignaling公司)。辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的驢抗兔標(biāo)記的第二抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)。低溫離心機(jī)F218型(美國(guó)Sigma公司)。　　12方法(1)染毒方法

4、及劑量：按每籠雄∶雌為1∶2自然交配。將受孕母鼠所生小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，共40只；對(duì)照組和24，48，96mmol/L染鉛組。從小鼠出生第1d起染鉛組母鼠開(kāi)始通過(guò)飲水飼以不同濃度(24，48，96mmol/L)醋酸鉛水溶液。對(duì)照組母鼠飲用自來(lái)水。為確保相同的營(yíng)養(yǎng)條件，每個(gè)母鼠最多喂養(yǎng)10只胎鼠。斷乳后幼鼠開(kāi)始自己飲用與其母鼠相同的飲用水。于出生后第14，28，42，56d解剖小鼠取出腦海馬，放入液氮中，轉(zhuǎn)存到-70℃冰箱中。(2)蛋白免疫印記法：將收集的樣品放到4℃預(yù)冷的裂解緩沖液

5、中，4℃超聲混勻(6s，6次)，4℃震蕩60min，離心25000g，60min，取上清分裝。用酚試劑法測(cè)蛋白，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。用10%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離蛋白質(zhì)，每孔蛋白加樣量為40μg。常規(guī)蛋白免疫印跡法測(cè)定pCREB含量。將蛋白印跡顯影圖掃描，再應(yīng)用ChemiImager5500V203圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。灰度值代表酶含量，以不同天數(shù)對(duì)照組的灰度值為100，其余各組與相應(yīng)天數(shù)的對(duì)照組比較?！　?3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS110軟件進(jìn)行單因素方

6、差分析?！　?結(jié)果　　21慢性鉛暴露對(duì)小鼠血鉛和腦海馬鉛含量的影響于小鼠出生后42d對(duì)血鉛和腦海馬鉛含量進(jìn)行測(cè)定，各慢性染鉛組小鼠血鉛和腦海馬鉛含量均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜001)，升高的程度與飲用水的鉛濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)表1。　　表1小鼠血鉛、海馬鉛濃度（略）　　注：與對(duì)照組比較，aP＜001；與同時(shí)期24mmol/L組比較，bP＜001；與同時(shí)期48mmol/L組比較，cP＜001　　22蛋白免疫印跡檢測(cè)pCREB結(jié)果本實(shí)驗(yàn)所用的一抗具有特異識(shí)別CREB的磷酸化Ser1

7、33特性，所以實(shí)驗(yàn)的灰度值代表pCREB。將實(shí)驗(yàn)后的電泳圖掃描后，以不同天數(shù)對(duì)照組的灰度值為100，其余各組與同時(shí)期天數(shù)的對(duì)照組比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除14d低劑量組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜001)。低劑量組鉛暴露對(duì)小鼠pCREB蛋白表達(dá)42d前呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且只有14d低劑量組略高于對(duì)照組。中劑量組鼠pCREB蛋白表達(dá)與同時(shí)期低劑量組比較只有14d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜001)。高劑量組鼠pCREB蛋白表達(dá)與同時(shí)期低劑量組相比較只有14，56d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜001)。各組pCREB蛋白表達(dá)

8、與其自身14d比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中、高劑量組分別在14和42d達(dá)谷底，分別下降了4294%和4221%，見(jiàn)表2，圖1?！　”?慢性鉛中毒對(duì)pCREB蛋白表達(dá)的影響（略）　　注：與同時(shí)期的對(duì)照組比較，aP＜001；與同時(shí)期24mmol/L組比較，bP＜001　　圖1KⅡ)等磷酸化，磷酸化后的CREB(pCREB)形成同源二聚體或與CREB/ATF(激活轉(zhuǎn)錄因子1)家庭的其他成員形成異二聚體，使CREB活化，與cAPM的應(yīng)元件(C