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《水產(chǎn)品中孔雀石綠的測(cè)定》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、XXX實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中心管理體系文件作業(yè)指導(dǎo)書(第A版第0次修改)文件編號(hào):編寫:審核:批準(zhǔn):批準(zhǔn)日期:受控狀態(tài):□受控□非受控正副版本:□正本□副本持有者:發(fā)布日期:實(shí)施日期:作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào):第頁(yè)共頁(yè)標(biāo)題:水產(chǎn)品中孔雀石綠的測(cè)定第A版第0次修改頒布日期:2014年月日1.目的使孔雀石綠的測(cè)定處于受控狀態(tài),保證孔雀石綠檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與一致性;規(guī)范參加本項(xiàng)目檢測(cè)工作人員的操作規(guī)程。2.適用范圍本作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)定了水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠殘留量的酶聯(lián)免疫測(cè)定方法。本作業(yè)指導(dǎo)書適用于魚、蝦以及魚池或者魚缸水樣中的總的孔雀石綠殘留量的檢測(cè)。3.引用依
2、據(jù)孔雀石綠酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書。水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的快速篩選測(cè)定酶聯(lián)免疫法DB34/T1421-2011水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)品紫及其代謝產(chǎn)物的快速測(cè)定方法SN/T1768-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法GB/T20361-20064.概述孔雀石綠是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體,既是殺真菌劑,又是染料。長(zhǎng)期以來(lái),漁民都用它來(lái)預(yù)防魚的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病等,而且為了使鱗受損的魚延長(zhǎng)生命,在運(yùn)輸過(guò)程中和存放池內(nèi),也常使用孔雀石綠。研究顯示,孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng),且具有高毒性、高殘留和致癌、致畸、
3、致突變等副作用。5.酶聯(lián)免疫吸附法5.1.原理本孔雀石綠類酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)試劑,主要是利用還原劑將樣品中的孔雀石綠還原成隱性孔雀石綠后,利用抗原與抗體之特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的基本原理來(lái)進(jìn)行的,換句話說(shuō),就是利用酶標(biāo)記物與樣品中之隱性孔雀石綠對(duì)微孔中之抗體來(lái)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。在整個(gè)反應(yīng)當(dāng)中,如果樣品中之隱性孔雀石綠殘留的越多,相對(duì)地就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)掉越多的抗體,使得結(jié)合了與微孔盤上包被的抗原結(jié)合抗體的二次抗體相對(duì)地就會(huì)減少。因此,反應(yīng)中之酶標(biāo)記物結(jié)合體-底物溶液之呈色就會(huì)很淡,甚至幾乎沒(méi)有顏色,此即為陽(yáng)性反應(yīng)。反之,若樣品中沒(méi)有含隱性孔雀石綠,則呈色會(huì)比較深,與陰性標(biāo)準(zhǔn)品呈色
4、幾乎是一樣的,此即為陰性反應(yīng)。5.2.試劑和材料5.2.1.實(shí)驗(yàn)室用試劑:所用試劑除另有規(guī)定外,均為分析純。水為符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào):第頁(yè)共頁(yè)標(biāo)題:水產(chǎn)品中孔雀石綠的測(cè)定第A版第0次修改頒布日期:2014年月日1.1.1.乙酸乙酯。1.1.2.正己烷。1.1.3.12N鹽酸溶液1.1.4.孔雀石綠酶聯(lián)免疫試劑盒1.2.儀器和設(shè)備1.2.1.酶標(biāo)儀:配備450nm濾光片。1.2.2.分析天平:感量0.001g,感量0.0001g。1.2.3.恒溫培養(yǎng)箱。1.2.4.均質(zhì)器。1.2.5.旋渦振蕩器。1.2.6.離心機(jī):離心力≥4
5、000g。1.2.7.氮吹儀1.2.8.微量單道/多道移液器:10μL~100μL;100μL~1000μL;50μL~300μL。1.2.9.水浴鍋。1.2.10.聚四氟乙烯離心管:5mL,50mL,具塞。1.3.樣品處理1.3.1.將2克已均質(zhì)之樣品放入15mL離心管中,加入0.4%還原劑3mL后立刻震蕩1分鐘使成肉漿狀。1.3.2.靜置30分鐘。1.3.3.再加入6mL0.002N鹽酸-乙酸乙酯,震蕩1分鐘。1.3.4.以離心機(jī)離心1700×g(約3500rpm)10分鐘。1.3.5.離心后若于上層有機(jī)層內(nèi)觀察到白色膠狀物時(shí),用竹棒或移液槍頭攪拌上層
6、有機(jī)層后再次以1700×g(約3500rpm)離心10分鐘。1.3.6.取3mL上層液(鹽酸-乙酸乙酯)至10mL玻璃管中,于60℃下,利用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑吹干。1.3.7.于此玻璃管中加入正己烷1mL,劇烈震蕩將殘余物完全溶解(若氮吹后的管內(nèi)有很多油脂時(shí),可將正己烷加入量改為2mL。)。1.3.8.緩緩加入1mL樣品稀釋液,輕柔混合震蕩(vortex)1分鐘。1.3.9.以離心機(jī)離心1700×g(約3500rpm)10分鐘。1.3.10.若離心后不能確實(shí)分層而在兩層問(wèn)出現(xiàn)乳化層時(shí),請(qǐng)置于沸水中隔水加熱至上下確實(shí)分作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào):第頁(yè)共頁(yè)標(biāo)題:水產(chǎn)品中孔
7、雀石綠的測(cè)定第A版第0次修改頒布日期:2014年月日層,待玻璃管冷卻至室溫后再次以離心機(jī)離心1700×g(約3500rpm)10分鐘。用吸管吸去上層液(正己烷),再吸取下層液(水層)備用稀釋倍數(shù):11.1.酶聯(lián)免疫測(cè)定1.1.1.使用前將試劑盒置于室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔條插入框架中,將不用的微孔條放入自封袋,保存于2-8℃不要冷凍;1.1.2.于適當(dāng)微孔分別加入100μL隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液。1.1.3.在另外的微孔加入100μL已完成前處理之樣品溶液。1.1.4.再于每一微孔另再加入
8、100μL的1倍隱性孔雀石綠抗體。1.1.5.輕敲盤子四周,使其充