差異表達基因克隆技術的新進展

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1、差異表達基因克隆技術的新進展　　提要分離并克隆差異表達基因是目前功能性基因研究的熱點。mRNA差異展示是篩選差異表達基因最有效的技術之一，它的主要不足是有一定假陽性。RDA、SSH、DSD、LSH技術能夠克服假陽性，但也具有一定的不足，應根據需要選擇運用。隨著能擴增長片段及具有自動校正功能的Taq酶出現及應用，這些技術將會不斷完善與發(fā)展，具有廣闊的應用前景?！　￡P鍵詞差異表達基因；克隆　　現代分子生物學研究表明，人類基因組約由10萬左右的不同基因組成，這些基因選擇性的表達決定了機體整個生命過程，基因表達的變化處于控制生物學調節(jié)機制的中心位置。因此，分離并克隆差異表達基因不僅有助于闡明

2、生命的粵秘，而且還能為基因診斷與治療提供重要的理論依據。近幾年來，差異表達基因克隆技術不斷完善與發(fā)展，已成為研究腫瘤和疾病等相關基因的重要手段?！　∫弧RNA差異展示　　mRNA差異展示（mRNAdifferentialdisplay,DDRT-PCR）是目前篩選差異表達基因最有效的方法之一，其基本原理是：3´端采用錨定引物，與mRNA3´polya結合，進行反轉錄，形成mRNA：cDNA雜交分子，5´端采用20條隨機引物，與錨定引物一起進行PCR擴增，其產物經測序膠顯示出來，再回收鑒定克隆差異條帶。1992年Liang和Pardee[1]建立此

3、技術時，5´端采用20條隨機引物，每條由10個堿基組成，3´端采用12條引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。這種組合從統(tǒng)計學上幾乎能完全覆蓋所有的mRNA序列，差異表達的基因會全部呈現出來。實踐證明，這種方法有效，但假陽性率在50%～70%左右，差異條帶在Northern印跡上重現性差，后續(xù)處理也比較復雜。1994年Ito[2]等對3´端引物進行了改進，把12條引物改為3條，即T12A、T12C、T12G，使得實驗操作簡化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端錨定引物與5´端隨機引物上皆增加10個堿

4、基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循環(huán)參數也改為前5個循環(huán)采用Liang和Pardee推薦的參數，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。經這樣改進，顯著地增強了差異條帶的重復性和敏感性，同時使得差異條逼帶的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]對5´端此物進行了改進，引物條數改為8條，皆帶上HindⅢ酶切位點，每條由13個堿基組成，3´端錨定引物采用3條，也帶上HindⅢ酶切位點，每條由18個堿基組成，PCR循環(huán)條件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40個循環(huán)，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我

5、們在Liang和Pardee改進的基礎上，對PCR循環(huán)參數進行了改進，即前5個循環(huán)采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35個循環(huán)采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。經這樣改進，既保持了擴增效率，又增強了差異條帶的特異性及重復性，降低了假陽性率?！　】傊?，mRNA差異展示具有簡便、快速、所需起始材料少、同時可在多個材料之間或不同處理材料之間進行比較等優(yōu)點，但具有較高頻率的假陽性和短小的差異片段的缺點，給后續(xù)處理帶來一系列問題，雖然此技術經過了一些起改進，但這兩個缺點仍限制著此方法的充分應用?！　《⒋硇圆钍痉治觥　〈硇圆钍痉治觯╮

6、epresentationaldifferenceanalysis,RDA）最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]將其應用于克隆差異表達基因，其基本原理是：靶方（Tester,T）和驅動方（Driver,D）的cDNA在進行差方式分析前均用一種識別4堿基序列的限制酶作切割處理，形成平均長度為256bp的cDNA片段代表群，第一次T與D雜交反應時，兩者總量比為1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指數形式擴增雙鏈模板，而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，通過降低cDNA群體復雜度和多次更換cDNA兩端接頭，來特

7、異擴增目的基因片段。特別是T減D雜交反應后僅設置了72℃復性與延伸及95℃變性這兩個循環(huán)參數，共20個循環(huán)，從而使PCR產物特異性大大提高。此技術最大的優(yōu)勢是差異條帶在Northern印跡上重現性好，假陽性少。缺點是所需起始材料較多，更多信賴于PCR技術，T與D之間若存在較多差異，或T中存在某些基因上調表達，則難達到預期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期長。　　三、抑制性扣除雜交　　抑制性扣除雜交（suppressionsubtractivehyb