基因槍介導(dǎo)bmp

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1、基因槍介導(dǎo)BMP前言盡管骨具有一定的自我修復(fù)能力，骨延遲愈合、骨不愈合等原因造成的長(zhǎng)管狀骨的節(jié)段性缺損是骨科較為常見(jiàn)且較棘手的問(wèn)題之一，常常導(dǎo)致骨不連的發(fā)生[1]。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療是結(jié)合鋼板的穩(wěn)定固定及骨移植。但這種方法將面臨的問(wèn)題是：骨缺損愈合后內(nèi)固定是否取出？若取出則需二次手術(shù)的創(chuàng)傷及住院費(fèi)用，若不取出則可能導(dǎo)致鋼板板斷裂在體內(nèi)或排斥反應(yīng)等其他并發(fā)癥得發(fā)生；另一方面，在骨移植中自體骨移植頗受青睞，但自體骨數(shù)量受限，且取自體骨會(huì)延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間、增加出血、感染等相關(guān)并發(fā)癥。因此，很多學(xué)者嘗試探索新的治療方法，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）在內(nèi)的能促進(jìn)骨修復(fù)的眾多細(xì)胞生長(zhǎng)因子漸漸為人

2、所知。BMP能夠誘導(dǎo)動(dòng)物或人體間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織。骨形態(tài)發(fā)生蛋白分諸多亞型，但很多研究結(jié)果提示：BMP-2與骨折愈合過(guò)程尤為密切相關(guān)。有學(xué)者建議用BMP-2治療骨不愈合。但由于骨形態(tài)發(fā)生蛋白在體內(nèi)被機(jī)體的酶類降解將很快失去生物活性，促使許多研究者將目光投向了骨形態(tài)發(fā)生蛋白的基因治療研究?；蜣D(zhuǎn)染是通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染骨形態(tài)發(fā)生蛋白目的基因后再注入體內(nèi)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以持續(xù)生產(chǎn)、釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白，發(fā)揮作用?；驑屖且环N將攜帶轉(zhuǎn)染后的目的基因的金屬微粒高速射入細(xì)胞、細(xì)胞器的轉(zhuǎn)基因裝置。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚缺乏基因槍介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染治療骨缺損的相關(guān)

3、報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探索使用基因槍進(jìn)行骨缺損治療的可行性、轉(zhuǎn)移基因在局部組織的存在時(shí)間及產(chǎn)生BMP-2蛋白的能力與蛋白活性，以期探索骨缺損治療的新方法和新思路。材料和方法1材料與設(shè)備(1)-80°C冰箱中科美菱(2)DR機(jī)德國(guó)西門(mén)子(3)線鋸美國(guó)賽盟茲鋸業(yè)(4)電泳儀北京百晶生物技術(shù)有限公司(5)酶標(biāo)儀美國(guó)寶特Bio-Tek(6)電子天平賽多利斯(7)1524高速微量離心機(jī)北京百晶生物技術(shù)有限公司(8)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)貝克曼庫(kù)爾特(9)各種型號(hào)離心管、濾器百川醫(yī)療器械有限公司(10)自動(dòng)雙蒸水蒸餾器成都雅榮生化設(shè)備實(shí)驗(yàn)儀器公司(11)電泳槽美國(guó)ABI公司1.2主要試劑及

4、耗材(1)苯甲基磺酰氟上海研卉生物科技有限公司(2)細(xì)胞裂解液上海研卉生物科技有限公司(3)定影粉冠龍照相器材廠(4)顯影粉冠龍照相器材廠(5)ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒上海博華生物科技有限公司(6)BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒上海研卉生物科技有限公司(7)SDS-PAGE凝膠配制試劑盒上海研卉生物科技有限公司(8)二抗稀釋液上海研卉生物科技有限公司(9)洗滌液上海研卉生物科技有限公司(10)封閉液上海研卉生物科技有限公司(11)一抗稀釋液上海研卉生物科技有限公司(12)SDS-PAGE電泳液上海研卉生物科技有限公司(13)轉(zhuǎn)膜液上海研卉生物科技有限公司(14)抗體洗脫液上海研卉生物

5、科技有限公司(15)甘油醛-3-磷酸脫氫酶康成生物公司(16)二抗JACKSON公司(17)預(yù)染蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)上海佳和生物科技有限公司(18)PVDF膜美國(guó)biomiga公司(19)3M濾紙(2020cm)美國(guó)biomiga公司2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新西蘭大白兔72只，雌雄不限，體重2~2.5kg，平均體重2.32kg。由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供[許可證號(hào)：SYXK<新>2010﹣0002]。飼養(yǎng)室條件：定時(shí)殺菌、消毒，溫度23℃左右，相對(duì)濕度：65%左右。對(duì)動(dòng)物的處理過(guò)程符合中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物倫理

6、學(xué)審查(中國(guó)新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：20100723008)。將72只兔編號(hào)后使用隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法隨機(jī)分為：（1）1.5cm組24只；（2）2.0cm組24只；（3）2.5cm組24只。各組又按干預(yù)隨機(jī)分：治療組（BMP-2基因治療組）12只和對(duì)照組12只。材料和方法........041.材料與設(shè)備.......042.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物......053.實(shí)驗(yàn)方法......054.標(biāo)本采集與檢測(cè)....075.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.......10結(jié)果.....11討論.....14小結(jié).....19討論1骨折的自然愈合進(jìn)程本實(shí)驗(yàn)中1.5cm對(duì)照組基本反映了新西蘭兔骨折愈合的自然進(jìn)

7、程：從1周后大體標(biāo)本的血腫機(jī)化填充，X線片的少量密度明顯低于正常骨質(zhì)的早期骨痂影；到4周后大體標(biāo)本的纖維性骨痂形成，X線片的較豐富骨痂形成，缺損兩斷端形成間斷骨橋連接；再到9周后大體標(biāo)本的缺乏光澤，質(zhì)較硬，表面凹凸不平呈灰白色的骨痂形成，X線片的較豐富骨痂形成，缺損兩斷端形成相對(duì)連續(xù)骨橋連接。動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示：骨折的自然進(jìn)程是一個(gè)較為緩慢而循序漸進(jìn)的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。骨是通過(guò)兩個(gè)不同的方式形成：軟骨內(nèi)骨化，軟骨組織逐漸被骨取代；膜內(nèi)骨化它不以軟骨為媒介，而是由間充質(zhì)細(xì)胞直接凝合而成[3]。在生命進(jìn)程中，