基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小麥的獲得與鑒定

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1、基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小麥的獲得與鑒定吳遠志（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢４３００７０）摘要：運用基因工程技術(shù)將外源抗病基因直接導(dǎo)入具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的小麥品種中，能夠獲得抗赤霉病小麥新品種。采用基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法，以ｂａｒ基因為篩選標(biāo)記，將幾丁質(zhì)酶基因?qū)腴L江中下游小麥栽培品種鄭麥９０２３，Ｔ０代經(jīng)過ＰＣＲ鑒定，獲得６株陽性植株，表明幾丁質(zhì)酶基因已整合到小麥基因組中。.jyqkpa，距離９ｃｍ，真空度93.13kPa，轟擊次數(shù)１次，每槍金粉用量為２５０μｇ，ＤＮＡ用量為１．５μｇ，根據(jù)Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司基因槍使用說明書提供的方法轟擊，轟擊后繼續(xù)高滲暗處理１６ｈ。１．２．４恢復(fù)培養(yǎng)及篩

2、選轟擊后的愈傷繼續(xù)高滲１６～２０ｈ，然后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基于２７℃中培養(yǎng)，根據(jù)愈傷組織在恢復(fù)培養(yǎng)基上生長的狀態(tài)，愈傷組織快速增殖開始出現(xiàn)大量胚狀體的時候，即可轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基。將恢復(fù)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基，待愈傷分化出抗性綠芽后轉(zhuǎn)入再生篩選培養(yǎng)基，將生長狀態(tài)良好的綠苗轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基。將生根篩選后存活的苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中壯苗，隨時觀察苗的狀態(tài)。當(dāng)幼苗明顯變綠，根系較發(fā)達時即可置于４℃春化，移栽至溫室。１．２．５轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ檢測用ＣＴＡＢ法提取小麥幼嫩葉片基因組ＤＮＡ。對目的基因進行ＰＣＲ檢測。以ｄｄＨ２Ｏ和未轉(zhuǎn)化的同一品種植株ＤＮＡ作陰性對照進行ＰＣＲ擴增，可以擴增出４

3、０８ｂｐ的特異性片段。ＰＣＲ儀為ＭＪ－１００型，反應(yīng)條件為：９５℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃變性４０ｓ，６１℃退火４０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，３５個循環(huán)；７２℃延伸１０ｍｉｎ，１０℃１０ｍｉｎ終止反應(yīng)。２結(jié)果與分析２．１小麥轉(zhuǎn)ｂａｒ基因植株篩選取開花后１２～１４ｄ的麥穗，剝?nèi)←溗胫虚g部位比較飽滿的體被白色絨毛呈嫩綠色的未成熟幼胚（圖１Ａ），在無菌條件下剝?nèi)“胪该鳡畹挠着?，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（圖１Ｂ），挑選呈淡黃色，顆粒狀，較致密的愈傷轉(zhuǎn)至高滲培養(yǎng)基，置于小皿中央的圓圈內(nèi)高滲處理４～６ｈ（圖１Ｃ），轟擊后的愈傷繼續(xù)高滲１６～２０ｈ，然后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基于２７℃培養(yǎng)（圖１Ｄ），恢復(fù)培養(yǎng)后愈傷組織

4、快速增殖出現(xiàn)大量胚狀體（圖１Ｅ），將恢復(fù)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基分化篩選（圖１Ｆ），分化篩選后愈傷分化出綠點（圖１Ｇ），將長出的綠苗分成單株，轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基篩選，得到部分抗性組培苗（圖１Ｈ），將生根篩選后存活的苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中，隨時觀察苗的狀態(tài)。當(dāng)幼苗明顯變綠，根系較發(fā)達時即可置于４℃春化，移栽至溫室（圖１Ｉ）。２．２轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ鑒定取鄭麥９０２３Ｔ０代植株的幼嫩葉片，用ＣＴＡＢ法提取小麥葉片ＤＮＡ，用幾丁質(zhì)酶基因的特異引物ＬＩ／ＵＥＲ對抗性植株進行ＰＣＲ鑒定，鄭麥９０２３在Ｔ０代獲得６株陽性植株（表１，圖２），表明幾丁質(zhì)酶基因已整合到小麥基因組中。３小結(jié)與討論幾丁

5、質(zhì)又稱殼多糖，是由Ｎ－乙酰葡萄糖胺通過β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖。廣泛存在于自然界中，是真菌類細(xì)胞壁的主要成分。通過基因工程的手段將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入小麥中，使小麥獲得分泌幾丁質(zhì)酶（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）的能力。當(dāng)禾谷鐮刀菌入侵小麥時，轉(zhuǎn)基因小麥分泌的幾丁質(zhì)酶可將此真菌的細(xì)胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，從而達到抗病的效果。在本研究中，幾丁質(zhì)酶基因具有廣譜抗菌功能，能抑制十幾種病原菌和非病原真菌的生長及孢子萌發(fā)，其幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)對細(xì)胞壁的高親和力導(dǎo)致其強烈的抑菌效果。Ｔ０代經(jīng)ＰＣＲ鑒定，獲得６株陽性植株，表明幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到小麥基因組中。ｂａｒ基因是從吸水鏈霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｈ

6、ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）中分離出來的，編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｔｈｒｉｃｉｎａｃｅｔｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＰＡＴ），ＰＡＴ能夠催化ＰＰＴ的游離氨基乙酰化，乙酰化的ＰＰＴ無法抑制ＧＳ活性，從而對ＰＰＴ起到解毒作用［１3］。含有ｂａｒ基因的植物具有對Ｂｉａｌａｐｈｏｓ的抗性，因此，ｂａｒ基因可作為選擇性標(biāo)記基因，利用其在轉(zhuǎn)化植物體內(nèi)中的表達，只要在篩選培養(yǎng)基中加入一定劑量的Ｂｉａｌａｐｈｏｓ，就會殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而生存下來的就是含有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在Ｂｉａｌａｐｈｏｓ篩選體系獲得抗性植株１６４株，經(jīng)ＰＣＲ鑒定，Ｔ０代才獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株６株。這種在Ｂｉａｌａｐ

7、ｈｏｓ篩選體系下抗性苗多而陽性苗少的現(xiàn)象，可能是由于植物細(xì)胞本身具有一定的耐受性和抗逆性，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使在高濃度的篩選劑篩選中也出現(xiàn)逃逸現(xiàn)象，產(chǎn)生假轉(zhuǎn)化體，還有可能是由于某些轉(zhuǎn)化組織的解毒能力很強，能夠使最接近的非轉(zhuǎn)化組織得到交叉保護［１4］。..