蛋白質(zhì)分離純化方法

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1、蛋白質(zhì)的分離純化方法2.1根據(jù)分子大小不同進行分離純化蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開,并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經(jīng)常和

2、鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用,在進行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由于超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質(zhì)的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。當?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實驗中,加入纖維素酶和α-淀粉酶進行預處理后,再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進行初步分離[3]。使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中

3、離心的方法稱為密度梯度(區(qū)帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而被排阻在凝膠珠之外,

4、隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動并最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]。2.2根據(jù)溶解度不同進行分離純化影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件

5、下,不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度,根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點,適當?shù)馗淖兺獠織l件,就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最低;相反,有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì)。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn),pH值為時茶葉蛋白提取效果最

6、好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4,使目標蛋白于等電點沉淀出來。等電點沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點為3·8。他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì),得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40min,葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚

7、魚肉蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白,蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達90%[12]。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。應(yīng)當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質(zhì),其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球

8、蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質(zhì)的破壞,應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象,蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2%~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進行提純后,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。有機溶劑提取法的原理是:與