蛋白質(zhì)的分離純化方法

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1、蛋白質(zhì)的分離純化方法2.1根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同,因此可以利用一些較簡(jiǎn)單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi),并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過(guò)濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無(wú)機(jī)鹽為主的

2、小分子分開(kāi)。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用,在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無(wú)機(jī)鹽。由于超濾過(guò)程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小。所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過(guò)濾得到更理想的效果離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開(kāi)。例如,在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后,再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初

3、步分離[3]。使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度(區(qū)帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度?？梢愿鶕?jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。蔣辰等[6]通過(guò)比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過(guò)濾也稱凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。凝膠過(guò)濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)

4、,比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過(guò)程中使用凝膠過(guò)濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過(guò)濾在抗凝血蛋白的提取過(guò)程中也被用來(lái)除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]。2.2根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化影響

5、蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度,根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件,就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn),而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低;相反,有些蛋白質(zhì)在一定pH值時(shí)很容易溶解。因而可

6、以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過(guò)程發(fā)現(xiàn),pH值為時(shí)茶葉蛋白提取效果最好,提取率達(dá)到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4,使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來(lái)。等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等[10]測(cè)得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3·8。他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì),得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40min,葡萄籽

7、蛋白質(zhì)提取率達(dá)73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚(yú)魚(yú)肉蛋白質(zhì)無(wú)腥味、色澤潔白,蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%[12]。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。應(yīng)當(dāng)指出,同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響的效果,要比一價(jià)離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來(lái)提取

8、蛋白質(zhì),其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞,應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象,蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2%~2·0%。利用鹽溶和鹽析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后,通常要使用透析或者凝膠過(guò)濾的方法除去中性鹽[13]。有機(jī)溶劑提取法的原理是:與