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《蛋白質(zhì)分離純化的方法doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、分離純化蛋白質(zhì)的四種關(guān)鍵性方法分離蛋白質(zhì)的方法有許多種，應(yīng)根據(jù)原材料和生產(chǎn)條件來選擇具體的分離純化方法。例如：李鳳英等[5]用鹽溶法提取葡萄籽的蛋白質(zhì)。李喜紅等[6]用酶法從脫脂米糠中提取蛋白質(zhì)。郭榮榮等[7]堿法與酶法與酶法提取大米蛋白工藝及功能特性比較研究得出結(jié)論是堿法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性優(yōu)于酶法提取的大米蛋白，而酶法提取的大米蛋白的溶解性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于堿法提取的大米蛋白。王桃云等[8]就是運用這種方法配合使用加熱法提取葎草葉蛋白。陳申如等[9]用酸法提取了鰱魚魚肉蛋白質(zhì)，
2、提取的蛋白質(zhì)無腥味，色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高，可達(dá)90%左右。以下介紹四種分離純化蛋白質(zhì)的方法。1區(qū)帶離心法區(qū)帶離心法是分離蛋白質(zhì)的有效而且常用的方法。該法的第一步是在離心管中形成一個密度梯度(常用蔗糖梯度)，然后將待分離的蛋白質(zhì)混合液放在密度梯度頂端。超速離心時，蛋白質(zhì)即通過密度梯度移動，并根據(jù)其沉降系數(shù)而被分開，最后各種蛋自質(zhì)在離心管內(nèi)被分離成各戶獨立的區(qū)帶，可以在管底刺一小孔逐滴放出，分部收集。2層析法最常用的層析法是凝膠過濾和離子交換柱層析。2.1凝膠過濾(GFC)[10-12]凝膠過濾也叫凝膠色譜和
3、分子篩層析，是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子的大小和形狀進(jìn)行分離的方法。凝膠過濾是一種快速而簡便的分離分析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的脫鹽、分離、提純、分析等等。柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物，最常用的是葡聚糖凝膠〔其他有聚丙烯酞胺凝膠和瓊脂糖凝膠等)。仙聚糖凝膠是具有不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，不同型號的葡聚糖凝膠其“網(wǎng)眼”大小不同，可以用來分離純化不同分子大小的物質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過層析柱時，比“網(wǎng)眼”大的蛋自質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，不能沿著顆粒間隙流動，流程短，流速快，最先流出柱外;比“網(wǎng)眼”
4、小的分子則進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，沿著孔道移動，從一個顆粒流出，又進(jìn)入另一顆粒，所以下移速度慢，隨后被洗脫下來。這樣，不同分子大小的蛋白質(zhì)由于流經(jīng)距離不同而得到分離。根據(jù)欲分離蛋白質(zhì)混合物的相對分子質(zhì)量的上限和下限選擇合適的凝膠[13]。凝膠過濾由于上樣量受到柱床體積限制，常用在純化路線的最后一步，此時的樣品蛋白溶液雜質(zhì)量很低了，經(jīng)過凝膠過濾就可純化。當(dāng)然，根據(jù)樣品蛋白溶液的特征，也有把凝膠過濾放在提純最初步驟中的[14]。而在在基因工程藥物蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中,必須要采取一些合理的措施保護(hù)目的蛋白質(zhì)的活性及穩(wěn)定性,如
5、在緩沖液中添加還原劑(如二硫蘇糖醇)阻止巰基基團(tuán)被氧化,添加蛋白酶抑制劑防止蛋白質(zhì)的降解,添加金屬鰲合劑(如EDTA)除去重金屬離子等,維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并保持其活性[15、16]。2.2離子交換柱層析[17、18]離子交換色譜廣泛地應(yīng)用于分離各種生物大分子，且在實際工業(yè)純化過程中包括一步或幾步離子交換的步驟[19]。傳統(tǒng)的離子交換色譜一般采用多糖類凝膠作為基質(zhì)，存在機(jī)械強(qiáng)度差、承受壓力小等缺點，不能進(jìn)行快速淋洗，且分離時間長，易造成生物分子的變性、失活。無機(jī)硅膠[20]填料機(jī)械強(qiáng)度大、柱效高、孔徑和顆粒大小
6、易于控制，但PH應(yīng)用范圍窄（2.0-8.0），在蛋白質(zhì)分離過程中硅膠表面殘余的硅羥基對蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附等缺陷，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率低，生物活性損失。硅膠涂敷固定相[21]在連續(xù)使用中涂層易脫落、穩(wěn)定性差。.聚合物基質(zhì)[22、23]固定相具有良好的生物兼容性、化學(xué)穩(wěn)定性及易于被衍生化的優(yōu)點，在生物大分子分離中的地位越來越重要。它的親水性減小了基質(zhì)與蛋白之間發(fā)生非特異性相互作用的機(jī)會，也可在PH=1一12內(nèi)廣泛使用。離子交換是指液相中的離子與固相(交換劑)上活性基團(tuán)離子的可逆交換反應(yīng)，利用此反應(yīng)將要分
7、離的混合物先在一定pH值的溶液中全部解離，而后流過固相使之與固相上的離子進(jìn)行交換，吸附于固相上。再根據(jù)混合物中各組分解離度的差別，用不同pH值的溶液分別洗脫下來。離子交換還可以與其他方法結(jié)合使用。例如HirokiTsukamoto等[24]利用凝血酶和離子交換色譜成功分離純化了融合蛋白。分離蛋自質(zhì)常用的交換劑是纖維素離子交換劑。在纖維素上引入不同的活性基團(tuán)(分酸性和堿性)，即成為不同類型的離子交換劑，其中，酸性基團(tuán)能解離出H+于溶液中的陽離子交換，稱為陽離子交換劑；堿性基團(tuán)能解離出OH一與溶液中的陰離子交換
8、，稱為陰離子交換劑。常用的陽離子交換劑是弱酸型能羧甲基纖維素(CM一纖維素)，陰離子交換劑是弱堿型的二乙氨基乙基纖維素(DEAE一纖維素)。纖維素離子交換劑對蛋白質(zhì)的交換容量大，分辨率高，能獲得較好的分離效果及較高的回收率。此外，在與液相中的離子交換后，對離子的吸附力較弱，在較溫和的條件下即可被洗脫下來，不影響蛋白質(zhì)的活性。蛋白質(zhì)混合物的分離可由改變?nèi)芤褐宣}類離子強(qiáng)度和pH來完成，對離子交換劑結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)首
