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1、葉綠素的提取、分離一、實驗?zāi)康?.掌握從植物葉中提取葉綠素的方法。2.了解紙層層析的原理，掌握紙層析的一般操作和定性鑒定方法。二、實驗原理1.葉綠素提取原理：葉綠素等是脂溶性的有機(jī)分子，根裾相似相溶的原理，葉綠體屮含有葉綠體色素（葉綠素a和b、胡蘿卜素及葉黃素）等色素分子溶于有機(jī)溶劑而不溶于有極性的水。故在研磨和收集葉綠色素時要用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑提取而不用水。2.色素分離的原理：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用浞合物屮各組分在；流動相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾
2、紙纖維常能吸20%左右的水），有機(jī)溶劑如乙醇等為流動相，色素提取液為層析試樣。把試樣點(diǎn)在濾紙的濾液細(xì)線位置上，當(dāng)流動相溶劑在濾紙的毛細(xì)管的作用下，連續(xù)不斷地沿著濾紙前進(jìn)通過濾液細(xì)線時，試樣屮各組份便隨著流動相溶劑肉前移動，并在流動相和固定相溶劑之間連續(xù)一次有一次的分配。結(jié)果分配比比較大的物質(zhì)移動速度較快，移動距離較遠(yuǎn)；分配比較小的物質(zhì)移動較慢，移動距離較近，試樣屮各組分分別聚集在濾紙的不同的位置上，從而達(dá)到分離的目的。毛細(xì)管點(diǎn)樣薄層色譜展開三、儀器和藥品研缽、毛細(xì)管、漏斗、紗布、小燒杯、試管、培養(yǎng)皿等95%酒精、丙酮、石油醚碳酸鈣
3、，石英砂四、實驗步驟（1）収菠菜或其他植物新鮮葉八20g左右，洗凈，用濾紙擦干，去掉葉柄和巾脈剪碎，放入研缽。（2）研缽中加入少量碳酸鈣和石英砂，加4-5ml無水乙醇，研磨至糊狀，再加10ml無水乙醇充分混勻以提取葉片勻漿中的色素，15-20分鐘后，過濾入50ml錐形瓶巾加塞待用。分離：（1）取圓形定性濾紙一張（直徑15cm）,將其剪成濾紙條（15cmx2cm）,將其2cm—端剪去兩側(cè)，中間留一長約1.5cm,寬約0.5cm的窄條，并在濾紙剪LI上方用鉛筆畫一條直線，作為畫濾液細(xì)線的基準(zhǔn)線（注意：濾液線必須距底邊l-1.5cm）。
4、用毛細(xì)管吸取乙醇葉綠體色素提取液，沿紙條的濾液線涂，等風(fēng)干后，再重復(fù)操作數(shù)2-3次。（用濾液涂圓點(diǎn)狀類似）（2）在層析缸巾加入適量（約2ml）的丙酮作為推動劑，將濾紙條帶有色素的一端輕輕插入層析缸巾，使濾紙條下端浸入推動劑中。迅速蓋好層析缸蓋，靜置40-60inin。此時，推動劑借毛細(xì)管引力順濾紙條向上擴(kuò)散，并把葉綠體色素向上推動，不久即可看到各種色素的條帶。（3）當(dāng)推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風(fēng)干，即可看到分離的各種色素，從上到下為：胡蘿卜素為橙黃色、葉黃素為鮮黃色、葉綠素a為藍(lán)綠色，葉綠素b為黃綠色，用鉛筆標(biāo)出各種色素
5、的位置和名稱。五、數(shù)據(jù)記錄六、注意事項：1.紙層析法中所用的有機(jī)溶劑如丙酮、石油醚等，一般有揮發(fā)性、并有一定毒性，使用時要注意密封層析，避免吸入過多有害揮發(fā)物。2.葉綠素分布于基粒的片層薄膜上，加入少許二氧化硅是為了磨碎細(xì)胞壁、質(zhì)膜、葉綠體被膜和光合片成，使色素溶解于酒精中。3.插入層析液的濾紙條一端剪去兩個角，由于液面的不同位置表面張力不同，紙條接近液而時，其邊緣的表而的張力較大，層析液沿濾紙邊緣擴(kuò)散過快，而導(dǎo)致色素帶分離不整齊的現(xiàn)象。4.加入的層析液要適量，濾紙放入層析缸時色素濾液線不能接入層析液，為了防止濾紙條倒入層析液中而
6、使層析實驗失敗。同時，防止因液體表而張力引起層析液沿濾紙條向上的“壁流”而導(dǎo)致色素溶解。七、思考題：1.在研磨時為什么加入適量的碳酸鈣粉末？2.在過濾時為什么選用脫脂棉或紗布，而不用濾紙？3.畫濾紙細(xì)線前濾紙必須經(jīng)過風(fēng)干處理，為什么不用火烤干或在烘箱內(nèi)烘干？
