鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對(duì)骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏的影響

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1、鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對(duì)骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏的影響：申文馬正良黃小冬曾因明【摘要】目的觀察脊髓水平氟代檸檬酸(fluorocitrate)對(duì)骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏的影響，探討脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在傷害性信息傳遞中的作用。方法C3H/HeJ小鼠48只，隨機(jī)分為6組(n=8):假手術(shù)組(Sham組)，骨癌組，骨癌+生理鹽水組，骨癌+氟代檸檬酸0.25nmol/5μl、0.50nmol/5μl、0.75nmol/5μl組。骨癌組和Sham組測(cè)定術(shù)前及術(shù)后7、12、17、21天小鼠機(jī)械縮腿閾值(ME2410A，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所生產(chǎn)。1.2細(xì)胞培

2、養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基采用NCTC135培養(yǎng)基，其中含有10%的馬血清，ATCC所推薦，每周傳代1次，按1∶4~6擴(kuò)增。1.3骨癌痛模型的建立參照Schg/kg,i.p)，行右膝關(guān)節(jié)切開術(shù)，暴露股骨關(guān)節(jié)面，然后用4號(hào)注射針頭鉆穿股骨，再換用20μl微量注射器將含有2×105個(gè)腫瘤細(xì)胞的α-MEM培養(yǎng)基(內(nèi)含1%牛血清白蛋白)20μl注入股骨遠(yuǎn)端，假手術(shù)組只注入20μlα-MEM培養(yǎng)基(內(nèi)含1%牛血清白蛋白)。注射完畢用牙科玻璃離子封住針孔，再用無菌生理鹽水沖洗創(chuàng)面，創(chuàng)口縫合。1.4小鼠鞘內(nèi)注射(intrathecalinjection,ith)按壓小鼠腰骶兩側(cè)

3、固定,自L5–6棘突間進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向運(yùn)動(dòng)為注射成功標(biāo)志。注射用10μl微量進(jìn)樣器進(jìn)行,注射容積為5μl，注射時(shí)間10s，留針20s。1.5動(dòng)物分組及給藥C3H/HeJ小鼠48只，隨機(jī)分為6組(n=8):假手術(shù)組(Sham)；骨癌+生理鹽水組：模型成功建立后17天鞘內(nèi)注射生理鹽水5μl；骨癌+氟代檸檬酸0.25nmol/5μl、0.5nmol/5μl、0.75nmol/5μl組：模型成功建立后第17天分別鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸0.25nmol/5μl、0.5nmol/5μl、0.75nmol/5μl。所有藥物均用生理鹽水稀釋到5μl。1.6行為學(xué)

4、測(cè)定Mol/μl組在給藥后30min時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)(P＜0.01)，并且持續(xù)到給藥后2h。給藥后2h各組均恢復(fù)到給藥前水平(見表2、3)。各鞘內(nèi)給藥組對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能均無影響。表2鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對(duì)骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏閾值的影響表3鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對(duì)骨癌痛小鼠熱痛敏閾值的影響3討論1999年，Schin之內(nèi)；其二，穿刺點(diǎn)用眼科玻璃離子封閉，此措施更易于封住針眼而不致腫瘤細(xì)胞從針孔外溢，導(dǎo)致腫瘤在骨外生長(zhǎng)，造成模型失敗，同時(shí)也要注意無菌操作。以往實(shí)驗(yàn)證明在慢性給予嗎啡引起的耐受中星形膠質(zhì)細(xì)胞的代謝產(chǎn)物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryac

5、idicprotein,GFAP）顯著升高，而給予氟代檸檬酸則可以減少嗎啡的耐受作用，增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛作用［6］，即抗膠質(zhì)細(xì)胞與嗎啡鎮(zhèn)痛有協(xié)同作用，間接證明了膠質(zhì)細(xì)胞可能參與疼痛的維持和發(fā)展。此外在神經(jīng)損傷以及炎性痛模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,鞘內(nèi)注射1nmol的氟代檸檬酸能夠明顯的減輕由于神經(jīng)損傷和炎癥引起的痛覺過敏和異常性疼痛［7-8］，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞與疼痛信息的傳遞關(guān)系密切。在本實(shí)驗(yàn)中我們建立穩(wěn)定的骨癌痛模型后，經(jīng)鞘內(nèi)注射星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑氟代檸檬酸，從行為學(xué)的角度觀察到其對(duì)骨癌痛小鼠具有鎮(zhèn)痛作用。在實(shí)驗(yàn)中采用鞘內(nèi)注射的方式，可使藥物直接作用于脊髓的不同

6、靶位，避免或最大限度地排除經(jīng)靜脈或腹腔給藥對(duì)機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的影響，使觀察結(jié)果更為可靠；3個(gè)劑量組的結(jié)果均顯示不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。對(duì)于大鼠1nmol劑量的氟代檸檬酸能夠完全、可逆的阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞的新陳代謝，而并不影響神經(jīng)元的代謝作用［9］。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察到,1nmol以上氟代檸檬酸鞘內(nèi)注入可使小鼠的活動(dòng)明顯增多，而本實(shí)驗(yàn)所用藥物劑量對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)功能無影響。實(shí)驗(yàn)中觀察到3個(gè)劑量組均能夠明顯減輕骨癌痛小鼠形成的機(jī)械痛敏和熱痛敏，且隨著劑量的增加而增強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間也延長(zhǎng)，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了骨癌痛小鼠傷害性信息的傳遞。其可能機(jī)制為：星形膠質(zhì)細(xì)胞是

7、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所，骨癌痛中星形膠質(zhì)細(xì)胞激活后導(dǎo)致神經(jīng)末梢谷氨酸堆積以至引起神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮；此外激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌一系列的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，改變神經(jīng)元周圍的神經(jīng)化學(xué)環(huán)境，導(dǎo)致中樞敏感化，而氟代檸檬酸能夠能夠通過抑制順烏頭酸酶而選擇性的抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的代謝活性，進(jìn)而抑制中樞敏化的形成而產(chǎn)生抗傷害作用。具體機(jī)制，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證明?！?/p>