原位肝移植缺血再灌注損傷對大鼠腎臟組織細胞凋亡的影響

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1、原位肝移植缺血再灌注損傷對大鼠腎臟組織細胞凋亡的影響作者：李波江淼禹化龍劉佳寧高壯雷胡三元【摘要】目的對比研究大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷對腎臟組織細胞凋亡的影響。方法參照Kamada“二袖套法”，建立Wistar大鼠原位肝移植動物模型，并以假手術組大鼠為對照組。分別于術后1、3、6、12、24h處死兩組動物，檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)水平變化。應用免疫組化(SP)法檢測腎臟凋亡細胞的Fas蛋白表達，應用流式細胞技術檢測腎臟細胞凋亡。結果肝移植組及對照組中BUN及CREA從術后1h開始上升,12h時達到高峰。兩組腎臟組織細胞術后1h即出現(xiàn)細胞凋亡，12h時達到高峰

2、。結論原位肝移植缺血再灌注損傷可致腎臟細胞凋亡，是腎臟細胞早期死亡的主要形式。【關鍵詞】原位肝移植;缺血再灌注損傷;細胞凋亡;腎臟原位肝移植作為終末期肝病的有效治療手段正得到廣泛的應用，隨著高效、強力免疫抑制劑的廣泛應用，急性免疫排斥反應的發(fā)生率已明顯降低。但是，肝移植病人術后出現(xiàn)急性腎衰竭者逐漸增多，其發(fā)生機制是什么?變化規(guī)律又是怎樣?國內外尚無文獻報道，本文就此問題進行探討。7　　1材料與方法　　1.1材料　　1.1.1動物健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，重200～250g，購自山東大學實驗動物中心?！　?.1.2分組隨機分為肝移植組及對照組，每組30只。分別于術后

3、1、3、6、12h和24h處死大鼠，每個時間點每組6只。　　1.1.3動物模型制作肝移植組：采用Kamada法〔1，2〕建立大鼠的原位肝移植模型。對照組：乙醚開放麻醉，上腹部正中切口進腹，切斷肝上部與膈肌相連之韌帶，游離肝十二指腸韌帶。游離肝下腔靜脈(IVC)，剪開覆蓋在IVC上的腹膜，游離右腎上腺靜脈，結扎并剪斷。再剪斷肝左葉與膈之間的韌帶，顯露左膈靜脈及左肝與食管間血管，結扎1次，關腹?！　?.1.4標本處理以上兩組動物乙醚麻醉后，行腹部大十字切口進腹，于肝下腔靜脈抽取靜脈血2.0ml，迅速注入生化試管中。再切取右腎組織，一半組織迅速放入液氮中保存，另一半組織用10%甲醛固定

4、，石蠟包埋備用。7　　1.2方法　　1.2.1腎功能檢查用全自動生化分析儀檢測各組大鼠術后1,3,6,12h和24h血漿中尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)水平?！　?.2.2免疫組化檢測腎臟細胞Fas表達的免疫組化檢測采用免疫組化(SP)法檢測，按照試劑盒說明書進行操作。結果判斷:陽性細胞為胞漿染色呈黃色或棕黃色。參照文獻〔3〕，用Imageproplus(MediaCybernetics公司，美國)專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)進行免疫組織化學定量研究:通過顯微鏡放大400倍攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)內。每只大鼠取5張切片，每張切片隨機選擇10個視野，10個視野測試面積作為包容空間，

5、將肝細胞Fas表達的陽性面積除以包容空間，取其均值作為陽性區(qū)域面積(陽性面積的百分率)作為表達指數(shù)(positiveexpressindex，PEI)?！　?.2.3細胞凋亡檢測采用流式細胞術(Flowcytometry，F(xiàn)CM)DNA含量分析法檢測缺血再灌注損傷(IRI)后不同時間點腎臟細胞的凋亡率。腎細胞懸液的制備按照操作說明書進行。將制備好的腎細胞混懸液染色后上流式細胞儀檢測。應用CellQuest軟件獲取細胞10000個，以ModFit軟件進行分析,測定細胞凋亡率(AI)，并繪制DNA含量直方圖。7　　1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以x±

6、s表示，均數(shù)間比較采用t檢驗?！　?結果　　2.1術后生存情況移植術后24h內，兩組大鼠均全部存活(100%)?！　?.2肝移植術后肝功及腎功的變化術后1h肝移植組即可見CREA、BUN顯著升高，術后3、6、12h其水平逐漸升高，至術后12h達最高峰，明顯高于對照組(P<0.05)。見表1?！　?.3Fas蛋白表達對照組僅有小部分腎小管上皮細胞核內可見Fas蛋白表達陽性顆粒，于術后12h達最高峰，陽性率約3%。肝移植組Fas蛋白在術后1h時即可見顯著表達，此后表達逐漸增強，術后12h時陽性細胞率達高峰，約16%，隨后表達開始逐漸下降，兩組相比差異顯著(P<0.05)。

7、見圖1。表1大鼠肝移植術后血清BUN、CREA變與對照組比較：1)P<0.05;下表同　　2.4腎臟細胞AI檢測對照組術后1h出現(xiàn)細胞凋亡，于術后12h達最高峰，陽性率約2.94%。肝移植組術后1h時即出現(xiàn)細胞凋亡，于術后12h達最高峰，AI為14.46%;隨后凋亡率開始下降，兩組相比差異顯著(P<0.05)。見表2，圖2。表27大鼠肝移植術后腎臟組織的PEI及AI(x±s，%)　　3討論　　IRI是指組織缺血缺氧達到一定程度和時間后將導致細胞損傷，而當缺血缺氧組織得