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《銀杏mect基因啟動子克隆及序列分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、銀杏MECT基因啟動子克隆及序列分析袁紅慧1，程華１，李琳玲１，陳小玲１，程水源２（１．黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡４３８０００；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢430023）摘要：以前期獲得的銀杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列為模板，通過設(shè)計特異性引物及采用染色體步移的方法從銀杏基因組中克隆到ＧｂＭＥＣＴ翻譯起始位點上游９８２ｂｐ的啟動子序列，研究銀杏ＭＥＣＴ基因啟動子的結(jié)構(gòu)及功能特點。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該啟動子序列中含有多種類型的順式作用元件，主要有典型的光
2、響應(yīng)調(diào)節(jié)元件、激素響應(yīng)調(diào)控元件、抗病蟲害響應(yīng)元件ＴＧＴＣＡ序列、抗損傷應(yīng)答元件ＥＲＦ３和熱激響應(yīng)元件ＨＳＥ等。此外，在該啟動子片段中還含有氧脅迫和銅離子響應(yīng)元件、淀粉酶響應(yīng)元件等其他類型的作用元件，充分體現(xiàn)了啟動子對基因表達調(diào)控具有轉(zhuǎn)錄水平上的高效性和復(fù)雜性的特點。..關(guān)鍵詞：銀杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）；染色體步移；２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤蘚醇－４－磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶基因；調(diào)控元件中圖分類號：Ｓ７９２．９５文獻標(biāo)識碼：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）０７－1746－０5DOI:10.14088/j.ki
3、.issn0439-8114.2015.07.055在銀杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）萜內(nèi)酯合成的ＭＥＰ途徑中，ＭＥＣＴ（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅＣｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＥＰｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是其第三步反應(yīng)的催化酶，催化２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤蘚醇－４－磷酸（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ－４－ｏｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）形成４－（胞苷５－焦磷酸）－２Ｃ－甲基赤蘚糖［４－（ｃｙｔｉｄｉｎｅ５－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ）－
4、２Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ，ＣＤＰ－ＭＥ］，并最終形成合成萜內(nèi)酯的前體物質(zhì)，因此ＭＥＣＴ是調(diào)控萜類物質(zhì)合成的一個關(guān)鍵酶。目前，已經(jīng)從銀杏（Ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ．Ｌ）［１］、擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）［２］、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）［３］、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［４］、水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）［５］、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）［６］、火炬松（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ）［７］等多種植物中克隆了ＭＥＣＴ基因。研究發(fā)現(xiàn)，在ＤＮＡ水平上，銀杏Ｍ
5、ＥＣＴ基因與擬南芥和水稻ＭＥＣＴ基因相似度分別達到了７０．７％和７０．２％。盡管已從多種植物中獲得ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列，但目前關(guān)于該基因啟動子表達調(diào)控方面的研究報道較少，尤其缺乏對該基因啟動子的基本結(jié)構(gòu)和功能分析方面的探究，本試驗通過染色體步移法克隆銀杏ＭＥＣＴ基因的啟動子，初步分析該啟動子所含的調(diào)節(jié)元件和作用特點，旨在為啟動子下一步的功能分析提供可靠依據(jù)。１材料與方法１．１試驗材料銀杏幼葉采自黃岡師范學(xué)院銀杏苗圃園，品種為家佛手１４年生實生苗。采后自封袋封裝，于－８０℃冰箱中冷凍保存。試驗所用大腸桿菌
6、（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０為經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室保存。１．２試驗試劑各種限制性內(nèi)切酶、ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ產(chǎn)物克隆載體ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００、Ｔ４ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ和Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ均購自大連寶生物工程有限公司；ＤＮＡ回收試劑盒為Ａｘｙｇｅｎ公司產(chǎn)品。各種寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。１．３試驗方法１．３．１銀杏ＤＮＡ提取采用改良的ＣＴＡＢ法［８］大量提取銀杏基因組ＤＮＡ。１．３．２基因組酶切與連接用
7、平末端限制酶ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ分別進行單酶切，３７℃酶切過夜（８ｈ），各取５μＬ用０．８％的瓊脂糖電泳檢測是否酶切完全，酶切產(chǎn)物分別純化回收；回收后與各自的接頭連接，體積為５０μＬ。連接反應(yīng)體系為ＤＮＡ酶切產(chǎn)物（模板）３０μＬ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ（１０×）５μＬ、接連體１０μＬ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ３μＬ、ｄｄＨ２Ｏ２μＬ，反應(yīng)程序為１６℃連接１２ｈ。１．３．３引物設(shè)計及染色體步移擴增根據(jù)Ｇｅｎｅｂａｎｋ提交的銀杏ＭＥＣＴ基因ｃＤ
8、ＮＡ序列（登錄號ＤＱ１０２３６０）分別設(shè)計引物ＭＴ１、ＭＴ２（表１），與２個接頭引物ＡＰ１、ＡＰ２形成巢式引物，進行第一次步移擴增。將得到的目的片段連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，送出測序。根據(jù)第一次擴增的啟動子序列，繼續(xù)設(shè)計引物ＭＴ３、ＭＴ４（表１）進行了第二次步移并測序。１．３．４目的片段回收、片段與載體連接、轉(zhuǎn)化及測序根據(jù)瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果，采用膠回收試劑盒回收所需的目的片段。所用的Ｔ載體為ｐ
