資源描述：
《農(nóng)桿菌介導ｐｈｙａ基因轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、農(nóng)桿菌介導ｐｈｙＡ基因轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化徐丹丹ａ，王丕武ｂ，趙邯鄲ａ，劉雙ａ，陳昭?。?，關淑艷ａ（吉林農(nóng)業(yè)大學，ａ．生命科學學院；ｂ．農(nóng)學院，長春１３０１１８）摘要：以根癌農(nóng)桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＥＨＡ１０５介導外源基因ｐｈｙＡ轉(zhuǎn)入玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）自交系ＧＳ０１的胚性愈傷組織，并利用除草劑（草胺磷）篩選出抗性愈傷組織，培養(yǎng)并獲得再生植株。結(jié)果表明，菌液濃度及侵染時間顯著影響愈傷組織的轉(zhuǎn)化率；不同激素種類及配比對抗性愈傷組織再生植株的影響明顯。當菌液濃度ＯＤ６００ｎｍ為０．６，侵染時間為２０ｍｉｎ時，抗性愈傷組織的轉(zhuǎn)化率最高，達到了６８．７％，為玉米農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
2、并獲得再生植株奠定了基礎。..關鍵詞：農(nóng)桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）自交系；遺傳轉(zhuǎn)化；ｐｈｙＡ基因中圖分類號：Ｓ５１３．０３２文獻標識碼：A：0439－８114（２０15）02－0465-03DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.02.054玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）是糧食作物中重要的工業(yè)原料，在全世界糧食生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位［１－３］。２０１０年，我國玉米種植面積達到了３２４萬ｈｍ２，成為世界第二大玉米生產(chǎn)國，而玉米也成為了我國的“谷物之王”［４］。玉米在我國經(jīng)濟生產(chǎn)中占有重要地位，因此大力提高玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)，成為
3、了眾多學者積極探尋的問題［５－７］。植酸酶能有效地水解食物以及土壤中植酸態(tài)有機磷，釋放出生命體可以直接吸收利用的無機磷酸及其鐵、鈣、鋅、鎂等鹽類，有效地提高了其生物利用率。因此，植酸酶基因克隆及導入受體組織并獲得可再生植株對研制植酸酶食品或飼料添加劑、開發(fā)高級保健食品和優(yōu)質(zhì)飼料、循環(huán)利用土壤中有機磷、緩解全球性磷礦產(chǎn)資源危機等具有重要意義［８－１３］。本研究以玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈傷組織為材料，將連有根部特異性啟動子和植酸酶基因ｐｈｙＡ的載體轉(zhuǎn)入玉米自交系中，對影響農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉(zhuǎn)化的因素進行探討，從而確定了農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的最佳菌液濃度及最佳侵染時間，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導玉米遺傳轉(zhuǎn)化條
4、件，并成功獲得玉米抗性苗，為基因工程育種打下了基礎，為獲得含有ｐｈｙＡ基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株提供了條件，同時為進一步提高玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)的研究奠定了基礎。１材料與方法１．１材料１．１．１外植體采用玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體進行轉(zhuǎn)化，由吉林農(nóng)業(yè)大學生物技術中心實驗室提供。１．１．２菌種含有ｐｈｙＡ基因和玉米根部特異啟動子基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ的根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５，由吉林農(nóng)業(yè)大學生物技術中心實驗室保存并提供。１．１．３培養(yǎng)基本試驗所用的培養(yǎng)基見表１。１．２方法１．２．１抗性愈傷篩選標記的確定本研究所構(gòu)建的表達載體為Ｂａ
5、ｒ基因的篩選標記，篩選培養(yǎng)采用除草劑篩選的方法，即用草胺磷進行篩選。１．２．２農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織１）農(nóng)桿菌菌液的制備。將帶有質(zhì)粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ單菌落，接種于含５ｍＬ卡那霉素的５ｍＬＹＥＰ液體培養(yǎng)基中，于２７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)過夜，再轉(zhuǎn)入５０ｍＬＹＥＰ液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（ＯＤ６００ｎｍ在０．５～０．６）時，收集菌體，重懸于ＭＳ液體培養(yǎng)基中待用。２）玉米愈傷組織的誘導。取授粉１２～１６ｄ的玉米自交系ＧＳ０１的幼穗，先用７５％乙醇消毒８～１０ｍｉｎ，再用０．５％次氯酸鈉浸泡消毒１２～１５ｍｉｎ，無菌水洗２～５次后，在無菌條件下取幼
6、胚接種于誘導培養(yǎng)基上，２６℃暗培養(yǎng)３～４周，產(chǎn)生Ⅰ型愈傷組織，每隔２～３周繼代１次，誘導出Ⅱ型胚性愈傷組織，作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。３）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織。將含有質(zhì)粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ的農(nóng)桿菌ＥＡＨ１０５的單菌落，接種于ＬＢ液體培養(yǎng)基（含有５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素）中，２７℃、１８０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（ＯＤ６００ｎｍ達到不同值），收集菌體，用同體積侵染培養(yǎng)基重懸菌體，用此菌液在三角瓶中侵染胚性愈傷組織１５～２５ｍｉｎ，每隔５ｍｉｎ振蕩１次，然后收集菌體，倒掉菌液，將愈傷組織放入鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干愈傷組織表面多余的菌液，然后轉(zhuǎn)入共體
7、培養(yǎng)基中（附加２００μｇ／ＬＡＳ）中２７℃暗培養(yǎng)３ｄ左右。４）愈傷組織的篩選、分化及植株再生。將愈傷組織移入篩選培養(yǎng)基中（含一定濃度的除草劑），篩選生長旺盛的新鮮的抗性愈傷繼代３次（每１５～２０ｄ左右繼代１次），抗性愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中，分化出苗，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根。再移栽到培養(yǎng)室盆栽，最后移栽到大田，進行田間栽培。２結(jié)果與分析２．１不同菌液濃度對玉米抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響農(nóng)桿菌的生長時期不同，侵染能力有
