樹突狀細(xì)胞疫苗在人源化裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫保護(hù)作用

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1、樹突狀細(xì)胞疫苗在人源化裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫保護(hù)作用.L.編輯。作者：李保東，付澤嫻，馬云龍，薛平，蔡建輝【摘要】目的探討樹突狀細(xì)胞（DCs）疫苗在人源化裸鼠體內(nèi)的抗胃癌免疫保護(hù)作用。方法制備DCRNA疫苗；建立人源化裸鼠模型；15只人源化裸鼠隨機(jī)分為DCRNA組、DCs組和PBS組，每組5只，分別用DCRNA、DCs和PBS皮下免疫注射2次，間隔1周，末次免疫后3天皮下接種胃癌細(xì)胞。各組裸鼠外周血人源性CD4﹢T細(xì)胞和CD8﹢T細(xì)胞的檢測(cè)和觀察GVHD反應(yīng)。觀察裸鼠瘤體積和瘤重。檢測(cè)細(xì)胞因子IL12和IFNγ水平。結(jié)果各組HuP

2、BTL裸鼠外周血中均檢測(cè)到人源性CD4﹢T細(xì)胞和CD8﹢T細(xì)胞，無(wú)GVHD反應(yīng)。DCRNA組瘤體積明顯小于DCs組和PBS組（P＜0.05）；DCRNA組瘤重明顯小于DCs組和PBS組（P=0.0452、P=0.0004），但DCs組和PBS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0618）；DCRNA組抑瘤率（53.7%）顯著高于DCs組（25.1%）（P＜0.05）。DCRNA組IL12和IFNγ水平明顯高于DCs組和PBS組（P<0.05、P<0.01）。結(jié)論HuPBTL腹腔注射，可成功構(gòu)建裸鼠人細(xì)胞免疫功能；DCRNA

3、疫苗在人源化裸鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗胃癌免疫保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞；疫苗；胃癌；裸鼠；人源化；細(xì)胞免疫樹突狀細(xì)胞（Dendriticcells,DCs）是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。近年來，國(guó)外DCs疫苗Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)治療惡性膠質(zhì)瘤[1]、腎癌[2]和結(jié)、直腸癌[3]等，說明DCs疫苗是安全可行的。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)胃癌總RNA轉(zhuǎn)染的DCs在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生抗胃癌特異性CTL[4]，在此基礎(chǔ)上，我們觀察胃癌總RNA轉(zhuǎn)染的DCs（DCRNA疫苗）在人源化裸鼠體內(nèi)抗胃癌免疫保護(hù)

4、作用。1材料和方法1.1材料胃癌細(xì)胞株BGC823，由河北醫(yī)科大學(xué)申海濤博士惠贈(zèng)。BALB/c（nu/nu）裸鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，SPF級(jí)，4～5周齡，體重18～20g，均為雌性。飼養(yǎng)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，籠具、水和墊料均高壓消毒，每3天更換1次。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，新生牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640完全培養(yǎng)基：以RPMI1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加10%滅活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激

5、因子（rhGMCSF）、重組人白細(xì)胞介素4（rhIL4）均為美國(guó)Reprotech公司產(chǎn)品。TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。FicollPaque淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于瑞典AmershamBiosciences公司。尼龍毛購(gòu)于日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。人IL12和IFNγ水平檢測(cè)ELISA試劑盒為深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。FITC/PE標(biāo)記鼠抗人單抗CD4、CD8購(gòu)于美國(guó)BioLegend公司。1.2方法1.2.1細(xì)胞BGC823培養(yǎng)和胃癌總RNA的提取和鑒定BGC823常規(guī)培養(yǎng)、消化傳代，取對(duì)數(shù)生

6、長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。消化、離心收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，按TRIzol試劑盒說明書抽提胃癌總RNA，取少量RNA測(cè)定OD260/OD280，計(jì)算總RNA含量和純度>1.8；瓊脂糖變性電泳可見完整18S、28S兩條帶，表明總RNA完整未降解。調(diào)細(xì)胞BGC823濃度為1×107/ml。1.2.2DCs的培養(yǎng)及DCRNA疫苗制備的健康成人外周血（肝素抗凝50U/ml）行密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），PBS洗滌3次，在完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，吸出未貼壁細(xì)胞；留下的貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞

7、儀（FCM）檢測(cè)其純度（>90%），調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，加入6孔板中，每孔加完全培養(yǎng)基、rhGMCSF100ng/ml和rhIL450ng/ml，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天半量換液及添加rhGMCSF和rhIL4。參考1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組裸鼠人細(xì)胞免疫重建成功的檢測(cè)和GVHD反應(yīng)各組HuPBTL裸鼠外周血中均檢測(cè)到人源性CD4﹢T細(xì)胞和CD8﹢T細(xì)胞，見圖1。各組裸鼠體重?zé)o明顯

8、變化，無(wú)皮疹、腹瀉等。2.2不同組荷瘤鼠腫瘤體積、瘤重及抑瘤率的比較DCRNA組瘤體積明顯小于DCs組和PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。DCRNA組瘤重（0.464±0.156）g明顯小于DCs組（0.750±0.