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1、PHEV感染對樹突狀細胞的活化及其細胞疫苗免疫保護作用Studyonimmuneeffectofdendriticcellsactivatedbyporcinehemagglutinationencephalomyelitisvirus作者姓名：趙家寬專業(yè)名稱：基礎獸醫(yī)學指導教師：賀文琦教授學位類別：農(nóng)學碩士答辯日期：2015年6月6日中文摘要PHEV感染對樹突狀細胞的活化及其細胞疫苗免疫保護作用豬血凝性腦脊髓炎病毒（Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus
2、，PHEV）屬于β冠狀病毒屬成員，其主要侵害3周齡以內的仔豬，臨床上常常表現(xiàn)為兩種類型，即嘔吐、衰竭或/和明顯的神經(jīng)癥狀，死亡率20%～100%。臨床上，PHEV多呈隱性感染，在豬群中不易察覺。盡管成年豬能夠較好的抵抗PHEV，但感染后會出現(xiàn)消瘦和發(fā)育不良等癥狀，且易于繼發(fā)其他病原的混合感染。目前，PHEV已在世界范圍內廣泛傳播，本課題組調查結果顯示，我國吉林、遼寧、山東等省份的豬群中PHEV感染率均為50%左右。研究表明，PHEV感染小鼠后通過神經(jīng)傳播，由于其發(fā)病急，機體的獲得性免疫應答并未完全啟動，感染
3、小鼠即已死亡，死亡率幾乎為100%。但在該病毒感染初期是否能被機體的免疫細胞所識別，目前還不清楚。樹突狀細胞（Dendriticcells，DC）是目前已知的處理呈遞抗原能力最強的抗原提呈細胞（Antigenpresentingcells，APCs）。對其他多種病毒感染的研究資料證實，DC能夠識別并呈遞病毒蛋白，分泌Ⅰ型干擾素及炎性細胞因子，以激活機體免疫系統(tǒng)清除并殺傷病毒感染細胞。但PHEV能否刺激DC活化，并且活化的DC對機體有無保護力未曾研究。為了解PHEV刺激對DC活化的影響，以及DC在PHEV感染
4、過程中參與免疫應答的能力，本研究首先分離了Balbc小鼠骨髓細胞，并通過條件培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)8天，獲得純度約77.69%的DC。將PHEV接種DC后，觀察到細胞體積變大、產(chǎn)生大量突起、貼壁能力強，說明細胞成熟、吞噬及黏附能力增強。PHEV刺激DC后可分泌大量的炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-12等，其中IL-1β在24h分泌量達到對照組的12倍；TNF-α持續(xù)高水平分泌，約為800～1000pg/mL，為對照組的16倍，差異極顯著；表明DC的免疫調節(jié)能力處于較高水平。FACS檢測到DC
5、的CD40、CD86、MHCⅡ等表達也均上調25%左右，說明DC呈遞抗原、刺激活化T細胞的能力增強。qPCR和WesternBlotting結果證明NFκB和炎性復合體通路活化；但IFN-α、β的表達被抑制，24h和48h的表達量不到對照組的10%，TLR7的表達也同樣被抑制。上述研究結果說明PHEV在體外能有效的活化DC并促使其成熟為有效的抗原提呈細胞，具有潛在的激活淋巴細胞反應的能力，為機體提供有效免疫保護。但被激活的DC并不能通過Ⅰ型干擾素途徑達到抗病毒反應。為了確定活化、成熟的DC對小鼠是否具有免疫
6、保護作用，以負載PHEV的DC作為細胞疫苗免疫小鼠，檢測到免疫小鼠血清中的細胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ上調1倍以上；血清PHEV抗體均呈陽性，說明小鼠體液免疫系統(tǒng)被激活。FACS分析免疫小鼠的脾臟細胞發(fā)現(xiàn)，無論是負載滅活病毒還是活病毒的DC疫苗經(jīng)過兩次免疫后，CD4/CD8均比第一次免疫后高接近1倍，IFN-γ分泌T細胞數(shù)量是對照組的1.5倍，說明小鼠的細胞免疫系統(tǒng)也同時被活化。I兩次加強免疫后，滴鼻接種致死劑量的PHEV，14天內負載PHEV的DC組死亡率為25%，而負載滅活PHEV的DC組死
7、亡率僅為20%，對照組則幾乎為100%，說明負載病毒的DC能夠為小鼠提供一定的免疫保護力抵抗PHEV感染。由此可見，PHEV能夠激活DC，促使其成熟、活化，表面蛋白表達，細胞因子分泌及NFκB和炎性復合體通路信號激活；負載病毒的DC疫苗能夠在一定程度上對小鼠提供免疫保護力。這些研究成果不僅為DC參與PHEV感染過程中的免疫應答機制奠定基礎，而且也為開發(fā)DC細胞疫苗抵抗PHEV感染提供了重要的參考依據(jù)。關鍵詞：豬血凝性腦脊髓炎病毒；樹突狀細胞；激活；疫苗；免疫保護IIAbstractStudyonimmune
8、effectofdendriticcellsactivatedbyporcinehemagglutinationencephalomyelitisvirusPorcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus(PHEV)belongingtobetacoronavirusisasingle-strandRNAviruses.PHEVcaninfectabout1~3week-
