日本醫(yī)蛭不同萃取部位體外抗凝活性的實驗研究

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1、日本醫(yī)蛭不同萃取部位體外抗凝活性的實驗研究姚楠余順慧相宇李友賓【摘要】　　目的研究日本醫(yī)蛭不同萃取部位的抗凝活性，為日本醫(yī)蛭的新藥開發(fā)提供依據(jù)。方法SD大鼠腹主脈取血，應(yīng)用血凝儀體外測定凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)和活化的部分凝血活酶時間(APTT)。結(jié)果日本醫(yī)蛭的總提物能使大鼠PT，TT，APTT時間顯著延長；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延長。結(jié)論中藥日本醫(yī)蛭的低極性小分子具有抗凝活性。【關(guān)鍵詞】日本醫(yī)蛭抗凝血　　水蛭作為藥用，歷史悠久。在中國，水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂其能“逐惡血、瘀血”“破血瘕積聚”。臨床廣泛用

2、于血栓形成、冠心病、腦水腫的治療〔1〕。世界上蛭類有數(shù)百種，中國也有近百種?！吨袊幍洹?005年版收載水蛭科動物螞蝗aniapigraan、日本醫(yī)蛭Hirudonipponicaan和柳葉螞蝗aniaacranulataan3種〔2〕?，F(xiàn)在公認(rèn)水蛭的活性成分為水蛭素，它是從醫(yī)蛭的唾液腺中提取出來的一種多肽，是作用很強(qiáng)的凝血酶抑制劑，具有抗凝、抗血栓等藥理作用。而中藥傳統(tǒng)應(yīng)用炮制的水蛭入藥，即水蛭要經(jīng)過開水燙死曬干或砂炒，水蛭素完全被破壞〔3，4〕，然而水蛭的破血、通經(jīng)的功效仍然得以保留，這說明水蛭中含有除水蛭素外的其它抗凝血成分。目前

3、人們對水蛭中蛋白多肽類活性成分研究較多，如抗凝血物質(zhì)水蛭素以及肝素、抗血栓素抗炎酶和溶血酶及組胺樣物質(zhì)〔5〕，而對小分子研究報道較少。有人研究了螞蝗的不同極性小分子部位的抗凝活性，證明中等極性的小分子具有較強(qiáng)的抗凝活性〔6〕。本文報道日本醫(yī)蛭不同萃取部位體外的抗凝活性，以期尋找其他有效的抗凝血小分子成分?！　?材料與儀器　　1.1動物SpragueDaan，標(biāo)本保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥化學(xué)室，標(biāo)本號2004-09-08?！　?.3試劑枸櫞酸鈉（分析純，中國上海試劑一廠，批號20020912）；水合氯醛（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公

4、司，批號T20060922）；TT，PT，APTT試劑（上海希森美康醫(yī)用電子有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號ZB/DadeBehing-04-2002?！　?.4儀器普利生PLSC2000-4型血小板聚集凝血因子分析儀?！　?方法　　　　2.1樣品液的制備日本醫(yī)蛭干品，加8倍量95％的乙醇回流提取3次，1.5h/次。合并3次提取液，減壓揮去溶劑得到總提物。將總提物分散于水中，分別用石油醚、氯仿、正丁醇萃取（正丁醇萃取后剩下的部分為水部位），各萃取物揮去溶劑分別得到石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部分。分別稱取總提取物2g，石油醚部位1.1g，氯

5、仿部位0.044g溶解于10ml的二甲亞砜中，正丁醇部位0.754g，溶于10ml3％吐溫，水部位0.646g溶于10ml生理鹽水，使各部位樣品液濃度均為830mg生藥/ml。　　2.2凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)的測定選用SD雄性大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，混勻后以3000r/min，離心15min，取血漿100μl，加入藥液10μl，預(yù)溫3min后加入預(yù)溫好的PT，TT試劑200μl，用血小板聚集凝血因子分析儀測定凝固時間。　　2.3活化的部分凝血活酶時間(APTT)的測定按“

6、2.2”方法分離出血漿，取血漿100μl，加入10μl藥液和APTT試劑100μl，預(yù)溫3min后加入預(yù)溫15min的CaCl2100μl，用血小板聚集凝血因子分析儀測定凝固時間?！　?.4統(tǒng)計方法統(tǒng)計方法用One-way-ANOVA，多組間兩兩比較，用LSD(Least-Signfieant-Diference)統(tǒng)計。　　3結(jié)果　　3.1日本醫(yī)蛭提取部位的抗凝血活性結(jié)果見表1～3。結(jié)果表明，總提物能使大鼠PT，TT，APTT時間顯著延長；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延長。經(jīng)SPSS軟件單因素方差分析，日本醫(yī)蛭總提物、石油醚部位抗凝

7、活性作用明顯強(qiáng)于其他提取部位?！　”?日本醫(yī)蛭總提物、石油醚部位、氯仿部位對大鼠PT，TT，APTT的影響（略）　　與二甲亞砜比較，*P0.05；n=4　　表2日本醫(yī)蛭水部位對大鼠PT，TT，APTT的影響（略）　　表3日本醫(yī)蛭正丁醇部位對大鼠PT，TT，APTT的影響（略）　　3.2提取物濃度與抗凝血活性的關(guān)系總提物和石油醚部位的濃度越高其抗凝血作用越強(qiáng)。在實驗范圍內(nèi)，總提物的濃度與PT，TT，APTT凝血指標(biāo)的延長呈線性關(guān)系。見圖1～2。　　圖1總提物濃度與凝血活性之間的關(guān)系（略）　　圖2石油醚部位濃度與凝血酶原時間之間的關(guān)系（略）

8、　　4討論　　凝血過程是一系列的酶促反應(yīng)，包括內(nèi)源性，外源性凝血系列和共同途徑。凝血酶原時間（PT），活化部分凝血活酶時間（APTT），凝血酶時間（TT）分別反映了外源性凝血系統(tǒng)和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的活性。其中