一節(jié)常規(guī)抗血清的制備方法

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1、抗體的制備與純化第一節(jié)常規(guī)抗血清的制備方法一、動(dòng)物的免疫二、抗血清的采集1、免疫動(dòng)物的選擇2、抗原接種3、佐劑的應(yīng)用動(dòng)物的免疫免疫動(dòng)物的選擇種屬與品系經(jīng)濟(jì)性“R”型與“H”型經(jīng)驗(yàn)性適配抗原接種劑量：注射途徑：間隔與免疫時(shí)間：接種次數(shù)：佐劑的概念與種類(lèi)概念：與抗原同時(shí)或先于抗原進(jìn)入機(jī)體，以提高抗原的免疫原性的物質(zhì)。種類(lèi)：非免疫原性物質(zhì)免疫原性物質(zhì)佐劑的作用機(jī)理延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間增強(qiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化”1、采集方法2、血清的分離與滅活抗血清的采集采

2、集方法一次性采集多次性采集抗血清的分離與滅活血清析出的溫度血清的滅活第二節(jié)單克隆抗體的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)二、單克隆抗體的制備過(guò)程三、單克隆抗體的特性單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)1、單克隆抗體2、雜交瘤技術(shù)表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體由一個(gè)識(shí)別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。雜交瘤技術(shù)通過(guò)融合經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞和建系小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時(shí)具有抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。單克

3、隆抗體制備過(guò)程1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3、細(xì)胞融合4、選擇性培養(yǎng)5、抗體分泌細(xì)胞的篩選6、克隆化過(guò)程7、單克隆抗體的制取抗原致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備動(dòng)物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100?g次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時(shí)間：末次接種后72h骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞株處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)細(xì)胞融合方式：物理、化學(xué)

4、、生物PEG融合要點(diǎn)：（見(jiàn)圖）致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液10ml離心1000rpm7min37。C搖動(dòng)、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)選擇性培養(yǎng)隨機(jī)融合后的細(xì)胞類(lèi)型HAT選擇培養(yǎng)原理隨機(jī)融合后的細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞組合HGPRT生長(zhǎng)狀態(tài)淋巴細(xì)胞+骨髓瘤+長(zhǎng)期生長(zhǎng)淋巴細(xì)胞+淋巴細(xì)胞+短期生長(zhǎng)骨髓瘤+骨髓瘤—不能生長(zhǎng)未融合淋巴細(xì)胞+短期生長(zhǎng)未融合骨髓瘤—不能生長(zhǎng)HAT選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（denovosynthe

5、sis）核苷酸補(bǔ)救合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）抗體分泌細(xì)胞的篩選對(duì)篩選方法的要求：多——大量樣品一次檢測(cè)快——迅速取得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)——檢測(cè)結(jié)果可靠性高靈——檢測(cè)方法靈敏度高常用篩選方法：ELISA、RIA、CDC、IFA等克隆化過(guò)程概念：建立單一細(xì)胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽(yáng)性孔飼養(yǎng)細(xì)胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細(xì)胞有限稀釋法計(jì)數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔單克隆抗體的制

6、取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類(lèi)型、親和力、效價(jià)、特異性決定簇鑒定——是否針對(duì)同一決定簇多抗與單抗制劑的比較多抗單抗單抗（血清）（腹水）（培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml）0.1-10.5-50.005-0.025無(wú)關(guān)Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白大量極少—均一性—++特異性多決定簇單決定簇單決定簇穩(wěn)定性較好略差略差重復(fù)性差好好單克隆抗體的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結(jié)合性高度特異3、生物活性高度單一第三

7、節(jié)抗體的純化與鑒定一、抗體純化的目的與方法二、純化抗體的鑒定與保存抗體純化的目的1、去除雜蛋白2、去除雜抗體3、去除非同類(lèi)抗體抗體純化的方法1、鹽析、層析技術(shù)2、抗原吸附純化抗體的鑒定1、多克隆抗體的鑒定2、單克隆抗體的鑒定純化抗體的保存1、4。C保存2、—20。C保存3、冷凍干燥保存本章小結(jié)1、多克隆抗體的制備2、雜交瘤技術(shù)的原理與應(yīng)用3、單克隆抗體的概念與特點(diǎn)4、抗體的純化與鑒定思考題1、比較多克隆抗體與單克隆抗體的特點(diǎn)并考慮其在應(yīng)用上的差異2、以雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的主要技術(shù)步驟有哪些？3

8、、如何對(duì)獲取的抗體進(jìn)行鑒定？