第一節(jié)常規(guī)抗血清的制備方法ppt課件.ppt

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1、抗體的制備與純化第一節(jié)常規(guī)抗血清的制備方法一、動物的免疫二、抗血清的采集1、免疫動物的選擇2、抗原接種3、佐劑的應用動物的免疫免疫動物的選擇種屬與品系經(jīng)濟性“R”型與“H”型經(jīng)驗性適配抗原接種劑量：注射途徑：間隔與免疫時間：接種次數(shù)：佐劑的概念與種類概念：與抗原同時或先于抗原進入機體，以提高抗原的免疫原性的物質。種類：非免疫原性物質免疫原性物質佐劑的作用機理延長抗原的作用時間增強吞噬作用刺激抗原提呈促進細胞因子分泌誘導淋巴細胞分裂、增殖影響T細胞“極化”1、采集方法2、血清的分離與滅活抗血清的采

2、集采集方法一次性采集多次性采集抗血清的分離與滅活血清析出的溫度血清的滅活第二節(jié)單克隆抗體的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術二、單克隆抗體的制備過程三、單克隆抗體的特性單克隆抗體與雜交瘤技術1、單克隆抗體2、雜交瘤技術表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。雜交瘤技術通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細胞和建系小鼠骨髓瘤細胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細胞永生性特征的雜交瘤細胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術途

3、徑。單克隆抗體制備過程1、致敏淋巴細胞的準備2、骨髓瘤細胞的準備3、細胞融合4、選擇性培養(yǎng)5、抗體分泌細胞的篩選6、克隆化過程7、單克隆抗體的制取抗原致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定致敏淋巴細胞的準備動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100?g次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時間：末次接種后72h骨髓瘤細胞的準備細胞株處于良好的生長狀態(tài)細胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)細胞融合方式

4、：物理、化學、生物PEG融合要點：（見圖）致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液10ml離心1000rpm7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)選擇性培養(yǎng)隨機融合后的細胞類型HAT選擇培養(yǎng)原理隨機融合后的細胞類型細胞組合HGPRT生長狀態(tài)淋巴細胞+骨髓瘤+長期生長淋巴細胞+淋巴細胞+短期生長骨髓瘤+骨髓瘤—不能生長未融合淋巴細胞+短期生長未融合骨髓瘤—不能生長HAT選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（deno

5、vosynthesis）核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）抗體分泌細胞的篩選對篩選方法的要求：多——大量樣品一次檢測快——迅速取得檢測結果準——檢測結果可靠性高靈——檢測方法靈敏度高常用篩選方法：ELISA、RIA、CDC、IFA等克隆化過程概念：建立單一細胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標準：連續(xù)兩次以上100%陽性孔飼養(yǎng)細胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細胞有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-

6、2/孔單克隆抗體的制取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定——是否針對同一決定簇多抗與單抗制劑的比較多抗單抗單抗（血清）（腹水）（培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml）0.1-10.5-50.005-0.025無關Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白大量極少—均一性—++特異性多決定簇單決定簇單決定簇穩(wěn)定性較好略差略差重復性差好好單克隆抗體的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結合性高度特異

7、3、生物活性高度單一第三節(jié)抗體的純化與鑒定一、抗體純化的目的與方法二、純化抗體的鑒定與保存抗體純化的目的1、去除雜蛋白2、去除雜抗體3、去除非同類抗體抗體純化的方法1、鹽析、層析技術2、抗原吸附純化抗體的鑒定1、多克隆抗體的鑒定2、單克隆抗體的鑒定純化抗體的保存1、4。C保存2、—20。C保存3、冷凍干燥保存本章小結1、多克隆抗體的制備2、雜交瘤技術的原理與應用3、單克隆抗體的概念與特點4、抗體的純化與鑒定思考題1、比較多克隆抗體與單克隆抗體的特點并考慮其在應用上的差異2、以雜交瘤技術制備單克隆

8、抗體的主要技術步驟有哪些？3、如何對獲取的抗體進行鑒定？愛是什么？一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。風兒若有若無。一只鳥兒飛過來，停在枝上，望著遠處將要成熟的稻田。精靈取出一束黃澄澄的稻谷問道：“你愛這稻谷嗎？”“愛。”“為什么？”“它驅趕我的饑餓?！兵B兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤的羽毛?！艾F(xiàn)在你愛這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。鳥兒抬頭望著遠處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛那一灣泉水，我有點渴了?！本`摘下一片樹葉，里面盛了一汪泉水。鳥兒喝完泉水，準備振翅飛去?！罢堅倩卮鹞乙粋€問題，”精靈伸出指